ADAMTS13蛋白C-末端結(jié)構(gòu)域及TSP1調(diào)節(jié)ADAMTS13酶活性的研究.pdf

1、ADAMTS13，又名血管性血友病因子裂解蛋白酶，其主要功能是特異性裂解血管性血友病因子(VWF)，從而調(diào)節(jié)抑制VWF介導(dǎo)的血小板血栓形成。2001年人ADAMTS13的基因首次被克隆報道，并定位于9號染色體長臂端(9q34)，基因全長37kb，主要由29個外顯子組成，其基因表達(dá)開放閱讀框為4284bp，編碼1427個氨基酸。ADAMTS13蛋白主要由9個結(jié)構(gòu)功能域組成，具體分別包括：信號肽、前導(dǎo)肽、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素結(jié)構(gòu)域、凝

2、血酶敏感蛋白1(TSP1)第1基序、富半胱氨酸區(qū)域、間隔區(qū)、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)第2-8重復(fù)基序、補(bǔ)體結(jié)合區(qū)域(CUB)，其中信號肽和前導(dǎo)肽在成熟ADAMTS13蛋白細(xì)胞分泌前被切掉。目前研究證實，ADAMTS13酶活性嚴(yán)重降低可以導(dǎo)致血栓性血小板減少性紫癜(TTP)的發(fā)病，不僅在TTP中，近年來在大多數(shù)血栓性傾向的疾病當(dāng)中均檢測到ADAMTS13酶活性的不同程度缺失，ADAMTS13基因的缺陷或其自身抗體的存在是已知的可以導(dǎo)致

3、酶功能活性嚴(yán)重缺失的主要病理因素，那么是否還有其他因素可以造成ADAMTS13酶活性的減少，最終導(dǎo)致血漿VWF降解程度的受損?對于ADAMTS13蛋白功能基礎(chǔ)調(diào)節(jié)的研究一直是血栓性疾病領(lǐng)域的研究熱點之一。我們在前期相關(guān)工作的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步深入研究分析了ADAMTS13酶活性的一些調(diào)節(jié)因素，以及初步探討了ADAMTS13與微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互關(guān)系，同時建立了一種新型的ADAMTS13的酶活性檢測方法。
　　 一、ADAMTS

4、13蛋白C-末端結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)自身酶活性的研究
　　 目前研究表明，ADAMTS13在酶切底物VWF的過程中存在著廣泛的相互結(jié)合，金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域是ADAMTS13蛋白酶活性發(fā)揮的關(guān)鍵中心，而去整合素結(jié)構(gòu)域、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)第1基序、富半胱氨酸區(qū)域、間隔區(qū)這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ陟o態(tài)條件下ADAMTS13酶活性的發(fā)揮有著重要的影響，尤其是間隔區(qū)，目前已經(jīng)證實在多數(shù)獲得性TTP患者當(dāng)中均檢測到間隔區(qū)位點自身抗體的存在。ADAMTS1

5、3蛋白C-末端結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為對于其酶活性的貢獻(xiàn)較小，然而C-末端CUB區(qū)域卻是ADAMTS13在該家族中所具有的特有性結(jié)構(gòu)域，近年來，有研究提示重組表達(dá)的ADAMTS13 C-末端蛋白多肽在高剪切力條件下可以競爭性抑制ADAMTS13酶活性，而且C-末端的TSP1重復(fù)基序與CUB區(qū)可能共同對于ADAMTS13酶活性的發(fā)揮起重要作用。因此，我們對于ADAMTS13蛋白C-末端結(jié)構(gòu)域功能進(jìn)行了初步的研究。
　　 首先，我們利用含人AD

6、AMTS13全長及去C-末端TSP8+CUB區(qū)截短型基因序列質(zhì)粒pSecTag-ADAMTS13-His，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)真核轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，經(jīng)潮霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)rADAMTS13的兩株細(xì)胞株，收集無血清培養(yǎng)上清，濃縮后上清經(jīng)過Ni-NTA Agarose柱子進(jìn)行純化，之后經(jīng)分光光度計測定OD280計算蛋白濃度以及Westerblot鑒定。結(jié)果表明：我們獲得了全長野生型及C-末端截短型rADAMTS13蛋白，初步OD280計算蛋白濃度

7、(野生型及截短型rADAMTS13蛋白分別為116ug/ml，126ug/ml)，Westerblot結(jié)果也證實其特異性，重組表達(dá)的蛋白分子大小與預(yù)期基本一致。
　　 其次，我們以純化的血漿VWF蛋白作為檢測底物，分別在靜態(tài)或動態(tài)渦流條件下，利用R-CBA法以及Reduced-SDS-PAGE法檢測了這兩種rADAMTS13蛋白的酶活性，同時利用ELISA方法檢測了這兩種rADAMTS13蛋白與VWF底物的結(jié)合能力。結(jié)果表明：在

8、靜態(tài)尿素變性條件下，Reduced-SDS-PAGE法檢測酶切后獲得的VWF176KD的特異性裂解片段來反應(yīng)酶活性的大小，發(fā)現(xiàn)野生型及截短型rADAMTS13蛋白均能對VWF進(jìn)行切割，但去C-末端的截短型rADAMTS13蛋白酶活性較野生型有所增強(qiáng)，R-CBA法定量檢測酶活性提示，野生型及截短型rADAMTS13蛋白的平均活性為61.23±7.67％、92.84±0.38％。二者之間有顯著差異(p<0.01)；ELISA法檢測分析靜態(tài)條

9、件下rADAMTS13與包被在96孔板上的VWF結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)無論是野生型還是截短型rADAMTS13蛋白，結(jié)合VWF的能力均隨著蛋白濃度的增高而增強(qiáng)，但截短型rADAMTS13蛋白結(jié)合VWF的能力明顯高于野生型；然而在高剪切力條件下，僅全長野生型rADAMTS13蛋白能對VWF進(jìn)行切割，但酶切能力較靜態(tài)條件下有所減弱，平均活性為41.34±18.06％，截短型rADAMTS13蛋白在高剪切力條件下幾乎檢測不到活性，活性低于5％。

10、>　　 二、TSP1調(diào)節(jié)ADAMTS13酶活性的研究
　　 血小板敏感蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP1)，同VWF一樣，也儲存于血小板α-顆粒，有研究發(fā)現(xiàn)，TSP1可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面VWF介導(dǎo)的血小板血栓形成，并推測認(rèn)為TSP1很可能是通過與vWFA3區(qū)的有效結(jié)合，從而競爭抑制了ADAMTS13酶活性的發(fā)揮。而ADAMTS13與VWFA區(qū)均存在著廣泛的結(jié)合，尤其是VWFA2區(qū)，考慮本實驗室初期已經(jīng)制備

11、表達(dá)了VWFA1、A3區(qū)蛋白，我們進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)了VWFA2區(qū)蛋白，并對TSP1調(diào)節(jié)ADAMTS13酶活性具體機(jī)制做初步的分析。
　　 首先，我們以含人vWF全長cDNA序列質(zhì)粒pSVvWF為模板，采用A2區(qū)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直接擴(kuò)增獲得VWFA2區(qū)基因片段，并用T4 DNA連接酶連接構(gòu)建了pUCm-T-VWFA2重組質(zhì)粒，之后雙酶切鑒定及測序分析，結(jié)果均表明克隆的A2區(qū)基因片段是完全正確的，于是我們再次成功連接構(gòu)建了P

12、QE30-VWFA2重組表達(dá)質(zhì)粒，利用該表達(dá)質(zhì)粒在M15表達(dá)菌中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA Agarose柱子對誘導(dǎo)表達(dá)蛋白進(jìn)行了純化，純化后電泳并經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色鑒定，可見約25 kD單一的蛋白條帶，分子量與我們預(yù)期表達(dá)的VWFA2區(qū)蛋白分子量相一致。結(jié)果證明我們獲得了純度很高的VWFA2區(qū)原核表達(dá)蛋白，這為進(jìn)一步研究其ADAMTS13酶蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 其次，我們分別以純化的血漿全長VWF蛋白、VWFA

13、1、A2、A3區(qū)為檢測底物，R-CBA以及Westerblot分析觀察TSP1直接對ADAMTS13酶切血漿全長VWF蛋白、A2區(qū)的影響，ELISA觀察TSP1直接對ADAMTS13結(jié)合血漿全長VWF蛋白、各A區(qū)蛋白的影響。結(jié)果提示：在生理最大TSP1濃度條件下，其可以顯著抑制ADAMTS13與VWF的相互結(jié)合；TSP1直接抑制ADAMTS13對VWF的裂解，最大抑制率可達(dá)70％；ADAMTS13與TSP1在VWF A2和A3區(qū)存在競爭

14、性結(jié)合位點，TSP1可以直接抑制ADAMST13對VWFA2區(qū)蛋白的裂解。
　　 三、ADAMTS13與微血管內(nèi)皮細(xì)胞關(guān)系的研究
　　 同肝臟星狀細(xì)胞一樣，血管內(nèi)皮細(xì)胞也是血漿ADAMTS13產(chǎn)生的主要來源，這一點已經(jīng)得到國外研究的證實在，但這些研究都集中的一些大血管內(nèi)皮細(xì)胞中，而對于微血管細(xì)胞中ADAMTS13的表達(dá)研究較少；ADAMTS13調(diào)節(jié)VWF介導(dǎo)的血小板血栓形成過程又主要發(fā)生在微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，那么對于微血

15、管內(nèi)皮細(xì)胞本身是否參與其局部血管周圍ADAMTS13酶活性的改變呢?另外，有報道提示ATRA可以通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)組織因子(TF)的表達(dá)，以及促進(jìn)其血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)等基因的表達(dá)，從而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的高凝狀態(tài)，那么ATRA對于微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分泌ADAMTS13與VWF平衡是否也存在影響?因此，我們帶著這些問題對ADAMTS13與微血管內(nèi)皮細(xì)胞關(guān)系做了初步的研究。
　　 首先，我們分別運(yùn)用流式

16、細(xì)胞技術(shù)和免疫熒光顯微鏡直接檢測觀察了微血管內(nèi)皮細(xì)胞株IIMEC-1中ADAMTS13表達(dá)情況，同時我們也利用免疫熒光顯微鏡檢測觀察了HMEC-1中VWF的表達(dá)分布情況，發(fā)現(xiàn)在微血管內(nèi)皮細(xì)胞株中的確存在大量ADAMTS13表達(dá)，并且內(nèi)皮細(xì)胞中ADAMTS13與VWF表達(dá)的分布有部分相同疊加區(qū)域，這一點與國外研究者在一些大血管內(nèi)皮細(xì)胞株中報道的情況相一致；我們也運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)初步檢測觀察了重組ADAMTS13蛋白與微血管內(nèi)皮細(xì)胞株HME

17、C-1膜表面相互作用，我們的檢測結(jié)果提示ADAMTS13可以與微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面相結(jié)合，這種結(jié)合可能并不依賴于ADAMTS13的C末端，并且這種結(jié)合可以被TSP1蛋白所阻斷。
　　 其次，我們分別利用實時定量PCR以及Westerblot技術(shù)，在基因和蛋白水平證實了ATRA可以上調(diào)微血管內(nèi)皮細(xì)胞中ADAMTS13的表達(dá)，從而增加分泌上清中ADAMTS13的酶活性。同時，我們也進(jìn)一步證實了部分炎性因子如TNF-α可以抑制血管內(nèi)皮

18、細(xì)胞ADAMTS13的表達(dá)，這與國外報道基本一致。我們的結(jié)果也表明，ATRA同樣可以逆轉(zhuǎn)TNF-α對ADAMTS13表達(dá)的抑制效應(yīng)，而ATRA對于HMEC-1中VWF的分泌并無影響。因此，我們認(rèn)為ATRA可以通過有效改善血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分泌ADAMTS13與VWF平衡的影響，從而改善機(jī)體的高凝狀態(tài)。
　　 四、一種新型ADAMTS13酶活性檢測方法的建立及其評價
　　 ADAMTS13酶活性的檢測不僅僅對于TTP的臨床診

19、斷有重要價值，而且可能對于TTP的預(yù)后評估也有指導(dǎo)意義。然而目前現(xiàn)有的一些檢測方法均存在不同程度的缺陷，無法推廣，鑒于此，繼續(xù)研究開發(fā)新型ADAMTS13酶活性檢測方法仍然是有必要的。我們利用我所特有的兩株新開發(fā)的VWF單克隆抗體--分別是針對VWFA1及A3區(qū)的單抗SZ129、SZ125，以血漿自身的VWF作為底物，建立了一種新型的ADAMTS13酶活性檢測方法，并對其進(jìn)行了初步的評價和臨床應(yīng)用。我們的結(jié)果表明：我們建立了一種新型的A