熒光標(biāo)記8個(gè)miniSTR及Amelogenin復(fù)合擴(kuò)增體系的建立.pdf

1、目前，PCR-STR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外法庭DNA實(shí)驗(yàn)室，成為個(gè)人識(shí)別和親權(quán)鑒定最主要的技術(shù)手段。在實(shí)際工作中，受氣候、環(huán)境、物理及化學(xué)等多種因素影響，該技術(shù)對(duì)降解檢材進(jìn)行STR分型時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增或者大片段基因座漏擴(kuò)。如何提高降解DNA樣本STR分型成功率成為國內(nèi)外法醫(yī)DNA專家關(guān)注的熱點(diǎn)。miniSTR技術(shù)通過重新設(shè)計(jì)引物，使引物更靠近重復(fù)序列，減少片段長度，能提高降解檢材STR分型的成功率。目前法醫(yī)學(xué)上廣泛使用的CODIS核

2、心STR基因座等位基因數(shù)較多，片段長度跨度較大，構(gòu)建miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系時(shí)只能同時(shí)擴(kuò)增較少的基因座，一次擴(kuò)增的系統(tǒng)效能較低。為此，尋找CODIS系統(tǒng)之外的適于建立miniSTR體系的基因座，建立高效的miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系十分必要。本研究篩選了11個(gè)非CODIS系統(tǒng)的miniSTR基因座進(jìn)行單個(gè)基因座的研究，從中選了多態(tài)性較好的8個(gè)miniSTR及Amelogenin建立熒光標(biāo)記的復(fù)合擴(kuò)增體系，顯示出良好的應(yīng)用前景。
　

3、　 本研究通過查找文獻(xiàn)及網(wǎng)站，合成PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，銀染法顯帶，初步篩選了11個(gè)miniSTR基因座：D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D2S441、D4S2364、D4S2408、D1GATA113。根據(jù)復(fù)合體系中各基因座的分布，調(diào)整部分基因座的引物，合成11個(gè)基因座的熒光標(biāo)記引物并進(jìn)行單個(gè)基因座擴(kuò)增，產(chǎn)物應(yīng)用毛細(xì)

4、管電泳檢測，檢驗(yàn)了廣州漢族100個(gè)無關(guān)個(gè)體的血樣，獲得11個(gè)基因座的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。選擇了其中多態(tài)性較高的8個(gè)基因座D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D2S441，加入性別鑒定的Amelogenin基因座，經(jīng)引物調(diào)整和組分優(yōu)化后構(gòu)建熒光復(fù)合擴(kuò)增體系。然后，應(yīng)用分子克隆技術(shù)，對(duì)9個(gè)基因座的58個(gè)等位基因進(jìn)行克隆，調(diào)整各基因座等位基因的含量，制備該體系的等位基因

5、分型標(biāo)準(zhǔn)物。最后，對(duì)該體系的靈敏度、種屬特異性、可重復(fù)性等進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)陳舊、腐敗降解檢材DNA的檢驗(yàn)?zāi)芰M(jìn)行研究。
　　 熒光標(biāo)記單個(gè)基因座的研究結(jié)果顯示，11個(gè)miniSTR基因座均能檢出分型明確的圖譜。在100名廣州漢族無關(guān)個(gè)體中D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D2S441、D4S2364、D4S2408、D1GATA113基因座分別檢出9、

6、6、8、8、7、6、5、9、5、5、和4個(gè)等位基因。通過Fisher精確檢驗(yàn)，該11個(gè)基因座的基因型數(shù)據(jù)均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P＞0.05)。11個(gè)miniSTR基因座的雜合度在0.6078～0.8137之間，個(gè)人識(shí)別率在0.7784～0.9241之間，非父排除率在0.3004～0.6248之間、多態(tài)性信息總量在0.5329～0.7702之間。
　　 本研究成功地建立了熒光標(biāo)記8個(gè)miniSTR及Amelo

7、genin復(fù)合擴(kuò)增體系，對(duì)常見的各類檢材均能檢出很好的STR分型圖譜。按公式計(jì)算，該體系8個(gè)miniSTR基因座的累計(jì)個(gè)人識(shí)別率為0.99999993，累計(jì)非父排除率為0.992287。該體系的檢測靈敏度為0.05ng模板DNA，具有種屬特異性和組織同一性，對(duì)肯定親緣關(guān)系30例父-母-子樣本進(jìn)行檢測未發(fā)現(xiàn)違反孟德爾遺傳規(guī)律的現(xiàn)象。對(duì)50份陳舊血樣的比對(duì)檢驗(yàn)顯示，該體系對(duì)降解檢材有良好的擴(kuò)增效果，較常規(guī)試劑盒的分型成功率高(p＜0.05)