基于CDK2和STAT3蛋白結(jié)構(gòu)的抗癌小分子的篩選、改造和生物活性檢測(cè).pdf

1、研究背景：隨著分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，作為受體的生物大分子的三維結(jié)構(gòu)被越來(lái)越多的發(fā)現(xiàn)和測(cè)定。根據(jù)已知生物大分子的結(jié)構(gòu)信息，利用計(jì)算化學(xué)和計(jì)算生物學(xué)方法篩選與其相互作用的小分子，即基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法（structure-based durg design，SBDD）。這個(gè)方法能夠大大降低新藥研發(fā)的成本和周期，因此越來(lái)越多的應(yīng)用在目前的藥物研發(fā)領(lǐng)域。
　　腫瘤作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，一直是科學(xué)家們致力于攻克的目標(biāo)。細(xì)

2、胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK），是絲/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員，是參與細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵酶。CDK2作為其中一個(gè)亞型，其與cyclinE和cyclinA結(jié)合后，能夠促進(jìn)細(xì)胞G1到S期的轉(zhuǎn)變，同時(shí)參與調(diào)控S期進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)80%的癌癥都會(huì)出現(xiàn)CDK2過(guò)表達(dá)，如肝癌，乳腺癌等，因此發(fā)現(xiàn)靶向作用于CDK2的抑制劑有利于發(fā)現(xiàn)新型抗癌藥物；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal trans

3、ducer and activator of transcription3，STAT3）參與JAK-STAT3信號(hào)通路的作用，JAK-STAT3信號(hào)通路是由細(xì)胞因子刺激而激活的信號(hào)通路，參與細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對(duì)細(xì)胞正常生理功能的維持起著不可或缺的作用。然而STAT3的持續(xù)激活會(huì)誘導(dǎo)一系列基因高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，惡性轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，促進(jìn)癌癥進(jìn)程。近年來(lái)也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)STAT3在多種癌癥中高表達(dá)，使得STAT3成為發(fā)

4、現(xiàn)抗癌藥物重要靶標(biāo)。目前CDK2-cyclinA復(fù)合物和STAT3的三維結(jié)構(gòu)都已發(fā)現(xiàn)并研究報(bào)道，這也為研究針對(duì)特異蛋白的小分子抑制劑提供了基礎(chǔ)。
　　研究目的：利用CDK2-cyclinA復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)作用于CDK2蛋白ATP口袋的新的母核結(jié)構(gòu)的化合物；利用STAT3晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靶向作用于其SH2結(jié)構(gòu)的抑制劑。
　　研究方法：本文以CDK2-cyclinA和STAT3蛋白三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，首先運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法

5、進(jìn)行分子對(duì)接，篩選商業(yè)化合物庫(kù)，對(duì)小分子進(jìn)行打分和排序，購(gòu)買其中打分靠前的小分子。對(duì)購(gòu)買的CDK2潛在小分子抑制劑進(jìn)行體外活性初篩，挑選活性最好的進(jìn)行藥物化學(xué)改造，以提高小分子的生物活性。將改造后具有相同母核、不同取代基的小分子進(jìn)行體外活性檢測(cè)，得到最好的小分子在癌細(xì)胞中進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)，接著運(yùn)用米氏方程驗(yàn)證小分子抑制劑的競(jìng)爭(zhēng)性。運(yùn)用FP實(shí)驗(yàn)對(duì)購(gòu)買的STAT3潛在小分子抑制劑進(jìn)行體外活性初篩，將活性較好的幾個(gè)在MDA-MB-468細(xì)胞中

6、進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)，最終篩出活性最好的一個(gè)在多種癌細(xì)胞中進(jìn)行CCK8驗(yàn)證。使用Biacore實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用位點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：CDK2抑制劑：初篩得到81號(hào)化合物，半數(shù)抑制濃度IC50是30.34μM。經(jīng)過(guò)藥物化學(xué)改造，得到CDK2抑制劑WZ-26，其IC50是3.81μM，較初篩得到的化合物活性提高了近10倍。在人源肝癌細(xì)胞HepG2中進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制檢測(cè)，其IC50是30.58μM；經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證WZ-026是ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。

7、STAT3抑制劑：FP實(shí)驗(yàn)初篩后挑選幾個(gè)對(duì)STAT3具有最佳結(jié)合力的小分子進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制檢測(cè)，最終得到作用于STAT3的抑制劑B9，在MDA-MB-468細(xì)胞中，IC50為5.1μM；在MDA-MB-231和DU145細(xì)胞中的IC50為18.87μM和63.77μM，表現(xiàn)出了明顯的細(xì)胞增殖抑制活性，同時(shí)還利用Biacore的方法驗(yàn)證了小分子的作用區(qū)域是STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域。
　　結(jié)論：運(yùn)用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法得到了：(1)