二氫楊梅素通過AMPK-SIRT1信號通路改善肝細胞脂肪變性的作用及機制研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝臟脂肪浸潤、單純性脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化和/或肝硬化以及肝癌為特征的臨床綜合征。近年來NAFLD的發(fā)病率越來越高，且越來越年輕化，全世界大約有15％～30％的成年人患有NAFLD。雖然大部分的非酒精性單純性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver, NAFL)患者早期并沒有出現肝功能損傷的情況，但是大約有1/5

2、的NAFL可能會繼續(xù)發(fā)展成非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化甚至肝癌。目前尚未發(fā)現防治NAFLD的理想措施，因此，NAFLD已發(fā)展為嚴重危害公眾健康的一大問題。
　　NAFLD的發(fā)病原因和機理還有爭議，目前“多重打擊”學說占主導地位，這一學說認為:胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)和高濃度游離脂肪酸(Free fatty acid, FFA)作為初

3、次打擊使得肝內脂質蓄積，導致肝細胞脂肪變性，從而對內、外源性損害因素的敏感性增加;第二次打擊主要是活性氧(Reactive oxygen species，ROS)導致的肝細胞氧化應激損傷及相關事件，引起肝臟發(fā)生炎性反應和纖維化;第三次打擊主要是氧化應激持續(xù)存在，炎癥-肝細胞壞死惡性循環(huán)，導致肝硬化甚至肝癌。由此可見，過量脂肪蓄積是NAFLD發(fā)生的必要條件，氧化應激是NAFLD發(fā)展的關鍵。近年來應用減肥藥、胰島素增敏劑、降脂藥或抗氧化劑（

4、如維生素E和C）等治療措施對NAFLD開展了大量的臨床研究，但尚未發(fā)現對NAFLD療效明確且無明顯副作用的治療藥物。一些黃酮類的植物提取物或植物化學成分具有良好的抗氧化、改善胰島素抵抗和調節(jié)脂質代謝等作用，被認為可能對NAFLD具有防治效果。二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DHM)是存在于藤茶中含量很高的一種天然黃酮類植物化合物，已有報道表明其具有調節(jié)糖脂代謝、保護高脂對肝臟損傷、改善脂肪肝等作用，但其作用機制還不是很清楚

5、。在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中，調控脂質合成的關鍵基因固醇調節(jié)元件結合蛋白1c(Sterol regulatoryelement binding protein-1c，SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase，FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)的表達明顯增加。DHM能否下調脂質合成有關基因的表達與活性而改善肝臟脂肪變性還有待進一步研究。
　　本實驗室

6、前期開展DHM對NAFLD人群干預研究發(fā)現DHM能夠改善NAFLD患者的脂代謝及炎癥反應，而在體外研究發(fā)現DHM也可以通過激活骨骼肌細胞AMPK信號通路改善其胰島素抵抗。有文獻報道，沉默信息調節(jié)因子(Silence information regulator1，SIRT1)和/或腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)的激活能夠改善肝細胞脂肪變性。因

7、此，本研究提出如下假說:DHM可能通過激活AMPK/SIRT1信號通路，調節(jié)肝細胞脂代謝、減少肝細胞的脂肪蓄積，改善肝細胞脂肪變性，成為防治NAFLD的理想植物化合物。本研究深入探討DHM改善肝細胞脂肪變性的可能分子機制，為NAFLD的防治及有效藥物研發(fā)提供實驗依據。
　　本課題使用0.2mmol/L棕櫚酸(Palmitic acid,PA)誘導HepG2細胞24h建立肝細胞脂肪變性模型，繼而用不同濃度DHM(0、5、10、20μ

8、mol/L)處理24h，首先用油紅O染色法、甘油三酯(Triglyceride，TG)含量測定法觀察DHM對細胞內脂質蓄積程度的影響;然后用免疫印跡法檢測細胞內SIRT1、AMPK、SREBP-1c、FAS、ACC的蛋白表達，qRT-PCR檢測SIRT1、SREBP-1c、FAS、ACC mRNA水平;最后，結合SIRT1和AMPK抑制劑、siRNA干擾，進一步探究AMPK/SIRT1信號通路在DHM改善肝細胞脂肪變性中的作用。

9、　　主要結果和結論如下:
　　(1)PA處理HepG2細胞導致細胞內脂肪蓄積增加，不同濃度的DHM處理后HepG2細胞中TG的含量和脂滴蓄積程度減少，表明DHM具有顯著改善HepG2細胞脂肪蓄積的作用。
　　(2)DHM處理脂肪變性的HepG2細胞后導致細胞內脂質合成相關基因SREBP-1c、FAS、ACC的蛋白表達及mRNA水平顯著降低，提示DHM通過下調HepG2細胞的脂質合成相關基因的表達與活性，抑制細胞內的脂質合成，

10、改善肝細胞脂肪變性。
　　(3)PA處理HepG2細胞后，SIRT1蛋白和mRNA水平以及AMPK尤其是磷酸化的AMPK蛋白水平顯著下降，而DHM處理后磷酸化的AMPK和SIRT1蛋白水平明顯增加，說明DHM能夠促進AMPK的磷酸化，上調AMPK的活性，同時上調SIRT1的表達而改善肝細胞脂肪蓄積。使用AMPK抑制劑CC抑制AMPK活性、SIRT1抑制劑EX527抑制SIRT1活性或siRNA沉默干擾SIRT1表達后再通過DHM處