Resveratrol調控AMPK-SIRT1通路去乙?；疞C3對MPTP帕金森病小鼠的保護作用及機制研究.pdf

1、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是中老年人常見的神經系統變性性疾病。目前 PD的治療措施主要是多巴胺（dopamine，DA）替代療法，只能緩解患者臨床癥狀，尚缺乏安全有效的延緩或改變PD病程進展的神經保護治療措施。研究表明，?-synuclein錯誤折疊、異常積聚導致的DA能神經元細胞功能紊亂是 PD神經細胞變性死亡的主要機制。通過誘導自噬，促進錯誤折疊或異常積聚的?-synuclein蛋白清除，可能有希望延緩

2、或改變PD的病程進展。
　　白藜蘆醇（resveratrol，RV）是一種非黃酮類天然多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、保護心腦血管等多種生物活性，且較易透過血－腦屏障進入腦組織。最近有研究證實，RV可能對6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）導致

3、的DA能神經元損傷具有保護作用。我們的前期研究也發(fā)現，RV能減輕線粒體神經毒素魚藤酮導致的SH-SY5Y細胞的凋亡，能降低?-synuclein過表達PC12細胞內?-synuclein的沉積，并且RV發(fā)揮上述作用可能與激活沉默信息調節(jié)蛋白1（silent information regulation2 homolog1，SIRT1）有關。為深入探討RV在活體內的作用效果和途徑，我們建立MPTP亞急性PD小鼠模型，用RV灌胃、SIRT1

4、特異性抑制劑EX527腹腔注射進行干預，在MPTP造模前及造模后的不同時間點進行行為學測試（包括開場試驗、足跡試驗和爬桿試驗）檢測其行為學改變，利用高效液相色譜電化學法(high performance liquid chromatography with electrochemical detection，HPLC-ED)檢測DA及其代謝產物變化，采用免疫熒光技術、western blot技術及蛋白質免疫共沉淀技術檢測相關蛋白表達變化

5、。從行為學改善和對黑質紋狀體多巴胺系統的保護作用兩個角度觀察RV對PD小鼠的保護作用，證實其有保護作用后，再對其可能的作用機制進行探索。本課題主要從以下兩個部分展開：
　　第一部分，白藜蘆醇調控 AMPK-SIRT1通路對 MPTP帕金森病小鼠的神經保護作用研究。我們發(fā)現，RV可以顯著改善 MPTP小鼠的行為學損傷、DA水平下降、黑質區(qū)TH陽性神經元丟失及紋狀體區(qū)TH蛋白表達減少。為了探索RV發(fā)揮保護作用的可能機制，我們在給予RV

6、灌胃時，同時腹腔注射SIRT1特異性抑制劑EX527。我們發(fā)現，給予RV后，小鼠黑質區(qū)SIRT1免疫熒光及紋狀體區(qū)SIRT1蛋白表達均較MPTP組顯著升高，同時p-AMPK蛋白表達較MPTP組亦顯著升高。而給予EX527后，小鼠黑質區(qū)SIRT1免疫熒光及紋狀體區(qū)SIRT1蛋白表達較RV+MPTP組顯著下降，伴隨著p-AMPK含量較RV+MPTP組顯著降低。同時，在給予EX527后，小鼠的行為學、DA水平、黑質區(qū)TH陽性神經元及紋狀體區(qū)T

7、H蛋白較RV+MPTP組顯著下降。提示RV對MPTP帕金森病小鼠的保護作用可能是通過激活SIRT1，進而激活AMPK而獲得。而我們前期的細胞實驗抑制AMPK磷酸化后，抑制了SIRT1活性。共同說明SIRT1與AMPK存在相互調控關系，且這種相互調控關系可能介導了RV對MPTP小鼠DA能神經元的神經保護作用。通過以上實驗，我們證明RV可能通過激活AMPK-SIRT1信號通路，SIRT1與AMPK相互調控，改善了MPTP小鼠行為學損傷，減輕

8、了MPTP小鼠DA水平下降，減少了黑質區(qū)TH陽性神經元丟失及紋狀體區(qū)TH蛋白減少。
　　第二部分，SIRT1去乙酰化LC3介導的自噬在?-synuclein降解中的作用。我們首先利用western blot技術檢測LC3-II、p62等自噬標志蛋白及?-synuclein，并采用免疫熒光雙標共定位p62和?-synuclein。我們發(fā)現在 MPTP組，SIRT1水平較對照組顯著降低，伴隨著 p62和?-synuclein共同積聚在

9、胞漿中；而當給予RV激活SIRT1后，LC3-II水平升高，共同積聚在細胞內的p62和?-synuclein較MPTP組顯著減少；當同時給予SIRT1特異性抑制劑EX527后，SIRT1水平下降，此時，LC3-II水平較RV+MPTP組顯著下降，與此同時，p62和?-synuclein共同積聚在胞漿。該實驗結果與我們課題組的前期細胞實驗共同證實RV激活 SIRT1后，SIRT1可通過進一步誘導自噬，促進?-synuclein降解，進而減

10、輕MPTP小鼠病理學損害和行為學損傷。為了進一步探索SIRT1對自噬的可能調控機制，我們采用蛋白質免疫共沉淀技術檢測LC3乙酰化水平及免疫熒光雙標?-synuclein和LC3觀察兩者相對亞細胞定位。我們發(fā)現，MPTP小鼠中SIRT1表達較對照組小鼠顯著下降后，LC3乙?；捷^對照組顯著升高，與此同時，LC3主要表達在細胞核內，伴隨著?-synuclein積聚在胞漿內。當給予小鼠 RV后，SIRT1表達較MPTP組顯著升高，LC3乙酰

11、化水平較MPTP組顯著下降，與此同時，LC3主要表達在胞漿中，積聚在胞漿內的?-synuclein被大量降解。給予 SIRT1特異性抑制劑 EX527后，我們觀察到 LC3乙?；捷^RV+MPTP組顯著升高，而與此同時，與MPTP組類似，LC3主要表達在胞核，伴隨著?-synuclein積聚在胞漿內。通過以上實驗，我們證實，SIRT1可能通過去乙酰化LC3，可以使LC3從胞核轉運至胞漿，進而誘導自噬，是RV對MPTP帕金森病小鼠發(fā)揮保