球孢白僵菌轉(zhuǎn)SPHvt-GNA融合毒力蛋白基因菌株的構(gòu)建及其對斯氏按蚊毒力的測定.pdf

1、目的：構(gòu)建轉(zhuǎn)SPHvt/GNA融合毒力蛋白基因的球孢白僵菌菌株，使得該轉(zhuǎn)基因菌株對蚊蟲的毒力增強，從而為控制蚊蟲及蚊媒傳染病提供新的思路。
　　方法:
　　1.將已知的澳大利亞漏斗網(wǎng)蜘蛛（Hadronyche versuta）產(chǎn)生的一種毒素ω-hexatoxin-Hv1a（SPHvt）和雪蓮花凝集素（Galanthus nivalis agglutinin，GNA）的氨基酸序列，根據(jù)Cordyceps bassiana的密碼

2、子偏好性進行優(yōu)化，獲得融合SPHvt/GNA基因序列，并在生物公司合成該融合基因。
　　2.運用分子克隆技術(shù)，通過設(shè)計酶切位點，酶切，載體與目的基因的連接等方法，以質(zhì)粒載體pBarGPE1、pBarGFP為基礎(chǔ)質(zhì)粒，構(gòu)建由gpdA啟動子驅(qū)動的flag為檢測標記，綠色熒光蛋白作為篩選標志物的重組質(zhì)粒載體pBarGFPSPHvt/GNA。
　　3.運用根癌農(nóng)桿菌介導的真菌遺傳轉(zhuǎn)化的方法將重組載體質(zhì)粒pBarGFPSPHvt/GN

3、A導入球孢白僵菌Bb252的基因組上，獲得轉(zhuǎn)SPHvt/GNA融合毒力蛋白基因的球孢白僵菌菌株。
　　4.對獲得的轉(zhuǎn)基因菌株進行熒光篩選，并在基因組水平，轉(zhuǎn)錄水平，蛋白水平進行驗證。
　　5.測定轉(zhuǎn)基因菌株Bb252::pBarGFPSPHvt/GNA對斯氏按蚊幼蟲的毒力并觀察其侵染斯氏按蚊幼蟲的過程。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了由gpdA啟動子驅(qū)動、flag為檢測標記、綠色熒光蛋白作為篩選標志物的重組載體質(zhì)粒pBarGFP

4、SPHvt/GNA，并篩選到發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因菌株，且經(jīng)基因組水平，轉(zhuǎn)錄水平，蛋白水平驗證表明成功獲得轉(zhuǎn)SPHvt/GNA融合毒力蛋白基因的球孢白僵菌菌株。對斯氏按蚊幼蟲的毒力測定中，該轉(zhuǎn)毒力蛋白基因菌株明顯比野生型菌株Bb252的毒力強。
　　結(jié)論：我們成功構(gòu)建了由gpdA啟動子驅(qū)動、flag為檢測標記、綠色熒光蛋白作為篩選標志物的重組載體質(zhì)粒pBarGFPSPHvt/GNA，并獲得了轉(zhuǎn)SPHvt/GNA融合毒力蛋白基因的球孢白