球毛殼菌絲氨酸蛋白酶基因克隆及原核表達研究.pdf

1、球毛殼菌（Chaetomium globosum）能侵染多種植物病原真菌，通過其體內(nèi)產(chǎn)生和釋放不同的的水解酶類和抗生素物質(zhì)來抑制真菌的生長。眾多的研究結(jié)果顯示：球毛殼菌（C.globosum）的各種酶能滲入到合適的宿主中并利用宿主的生物體作為營養(yǎng)來源進行生長，由于這樣的寄生作用，球毛殼菌（C.globosum）已被用于多種植物病原真菌的生物防治。多種證據(jù)表明球毛殼菌（C.globosum）能夠減少許多重要農(nóng)業(yè)病原菌的發(fā)病率和危害范圍。球

2、毛殼菌（C.globosum）中一些與生物防治相關(guān)的基因已經(jīng)被克隆出來，如幾丁質(zhì)酶和木聚糖酶。然而，關(guān)于球毛殼菌（C. globosum）中在生物防治中起著重要作用的蛋白酶類的研究較少。
　　本研究從球毛殼菌（C.globosum）中獲得了與枯草桿菌蛋白酶相似的絲氨酸蛋白酶基因（ser）的DNA和cDNA序列。全長cDNA克隆的5’-和3’-端序列，已經(jīng)從全菌的EST文庫中采取分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的方法獲得。在這兩個EST的基礎(chǔ)

3、上，球毛殼菌的類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶已經(jīng)通過PCR方法擴增出來，cDNA和mRNA的全序列已經(jīng)呈遞給NCBI，并得到序列號分別為FJ589720and FJ589721。結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方法，從球毛殼菌（C.globosum）的cDNA文庫中成功克隆出絲氨酸蛋白酶基因（ser）的cDNA序列。cDNA的全長為1608-bp，編碼535個氨基酸，預(yù)測的分子量為57.2 kDa；等電點為5.93。DNA序列長為1682-bp，由2

4、個外顯子和1個內(nèi)含子組成。兩個外顯子的長度分別為372和1236-bp，內(nèi)含子的長度為74-bp。外顯子和內(nèi)含子之間的剪切位點符合GT/AG規(guī)則。SignalP預(yù)測分析顯示：絲氨酸蛋白酶基因（ser）為分泌蛋白，在 N端有一個由16個氨基酸殘基組成的信號肽序列，信號肽的切割位點位于第15位和第16位的丙氨酸（Ala）之間。從此基因推導(dǎo)出的氨基酸序列與其它真菌來源的絲氨酸蛋白酶有超過80％的同源性，初步斷定它屬于S8超家族。
　　在

5、細菌啟動子P7的作用下，用用大腸桿菌表達質(zhì)粒pET-52b(+)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-52b/Ser，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli TOP10中，并將抽提出的經(jīng)過復(fù)制的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21后進行蛋白酶的表達研究。這兩次轉(zhuǎn)化過程，均經(jīng)過菌落PCR和限制性內(nèi)切酶雙酶切檢驗。SDS-PAGE結(jié)果顯示，目的基因表達不明顯；酶活性檢測為在誘導(dǎo)5h后絲氨酸蛋白酶活性最高為0.171U/10ml。絲氨酸蛋白酶的最適pH為4.5，在pH