日本血吸蟲SjC1qBP基因的克隆表達(dá)及生物學(xué)功能研究.pdf

1、血吸蟲病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲??；目前，全球約有兩億人受到感染，八億人面臨著被感染的威脅。吡喹酮是血吸蟲病治療的首選藥物，但其30多年的使用歷史可能導(dǎo)致宿主產(chǎn)生耐藥性，并且該藥不能解決重復(fù)感染的問題。一直以來，研發(fā)血吸蟲免疫預(yù)防疫苗是研究的熱點(diǎn)方向之一，但研究進(jìn)展相當(dāng)緩慢，目前仍然缺乏有效的抗血吸蟲病疫苗。處于機(jī)體防御第一線的補(bǔ)體系統(tǒng)是宿主殺傷血液內(nèi)寄生蟲的重要途徑，可以迅速標(biāo)記并清除入侵的病原微生物，介導(dǎo)體液免疫和細(xì)

2、胞免疫，是機(jī)體中重要的免疫調(diào)控和效應(yīng)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)；血吸蟲在長期的進(jìn)化過程中形成了非常成功的免疫逃避策略，一些血吸蟲分子能夠調(diào)節(jié)宿主的補(bǔ)體系統(tǒng)，這些分子對(duì)血吸蟲在終末宿主體內(nèi)的生存和發(fā)育起著極其重要的作用，是潛在的疫苗候選分子和理想的藥物靶標(biāo)。在日本血吸蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究中曾鑒定到C1q結(jié)合蛋白（C1qBP），推測(cè)其可能和日本血吸蟲的補(bǔ)體抑制相關(guān)。
　　本研究通過PCR擴(kuò)增了日本血吸蟲C1q結(jié)合蛋白（SjC1qBP）基因的開放閱讀框，

3、經(jīng)生物信息學(xué)分析表明該基因ORF含729個(gè)核苷酸，編碼242個(gè)氨基酸殘基，既不存在跨膜區(qū)，也不存在信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該基因編碼的多肽以無規(guī)則卷曲為主，SMART軟件分析該蛋白氨基酸序列結(jié)果顯示其屬于Pfam家族蛋白含有MAM33結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其具有補(bǔ)體C1q結(jié)合位點(diǎn)；RT-PCR分析表明SjC1qBP基因在日本血吸蟲的各個(gè)發(fā)育階段均可轉(zhuǎn)錄，其中在尾蚴中的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)較高，而在蟲卵等其他階段其轉(zhuǎn)錄水平大致相當(dāng)；免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sj

4、C1qBP蛋白在蟲卵中有分布、在日本血吸蟲成蟲中主要分布于體被。
　　本研究構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-SjC1qBP，并在大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中成功表達(dá)，并應(yīng)用親和層析方法純化獲得了包涵體重組蛋白，利用尿素濃度梯度透析得到了復(fù)性的重組蛋白分子rSjC1qBP；Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明rSjC1qBP具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性；動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，該重組蛋白誘導(dǎo)了有31.48％的減蟲率以及

5、45.12%的肝臟減卵率，同時(shí)重組蛋白 rSjC1qBP分子經(jīng)凝血酶酶切后獲得的蛋白亞單位也誘導(dǎo)產(chǎn)生了顯著的免疫保護(hù)效果；對(duì)該重組蛋白分子誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答分析表明，重組蛋白分子 rSjC1qBP在首次免疫后就產(chǎn)生了較高水平的特異性抗體IgG，且抗體水平隨免疫次數(shù)的增加而不斷升高，到小鼠感染42d剖殺前抗體水平仍維持高水平。
　　綿羊紅細(xì)胞溶血抑制實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果表明，重組蛋白分子 rSjC1qBP抑制補(bǔ)體溶血的現(xiàn)象非常明顯，并

6、且隨著重組蛋白rSjC1qBP分子濃度的增加抑制作用越明顯，在濃度達(dá)到1.5mg/mL時(shí)，溶血反應(yīng)抑制率大于80%。在補(bǔ)體分子結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，重組蛋白分子rSjC1qBP能特異地與C1q蛋白結(jié)合，表明日本血吸蟲重組蛋白分子rSjC1qBP能夠競(jìng)爭性結(jié)合C1q，從而抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑。
　　本研究結(jié)果表明，日本血吸蟲 SjC1qBP能通過結(jié)合補(bǔ)體 C1q而抑制宿主補(bǔ)體溶血，該分子還具有血吸蟲疫苗候選抗原分子的潛力，結(jié)果不僅拓展了對(duì)SjC1