S100β基因修飾的嗅鞘細胞在炎性環(huán)境中的作用.pdf

1、目的：
　　利用S100β基因修飾的嗅鞘細胞體外炎癥模型，探討S100β對炎癥環(huán)境中嗅鞘細胞的作用及機制。
　　方法：
　　①嗅球取自新生7天SD乳鼠，嗅鞘細胞（OECs）的培養(yǎng)采用差速貼壁改良法聯(lián)合胰酶限時消化法純化；
　?、诶寐《据d體LV5（EF-1aF/GFP&Puro）分別將S100β或空載體轉(zhuǎn)染嗅鞘細胞并分組為S100β-OECs組和空載體-OECs組；采用流式細胞儀驗證轉(zhuǎn)染效率。
　?、劾?/p>

2、CCK-8法在1、3、5、7d分別檢測病毒轉(zhuǎn)染OECs（S100β-OECs組/空載體-OECs組）和未轉(zhuǎn)染OECs對照組細胞增殖情況。
　　④通過在兩組培養(yǎng)體系添加重組IFN-γ建立嗅鞘細胞的體外炎癥模型，在誘導(dǎo)炎癥0、3、6、12、24h后，通過TUNNEL染色法觀察各組OECs凋亡狀況；
　?、莶捎脤崟r熒光定量PCR檢測S100β-OECs組和空載體-OECs組的S100β、凋亡因子Bax、Puma、抗凋亡因子Bcl-

3、2和炎癥相關(guān)因子INOS、IL-1β、TNF-α的基因表達水平；利用蛋白免疫印跡法檢測兩組在誘導(dǎo)炎癥后不同時間點的S100β、p65、p38、ERK1/2、P-JNK等蛋白含量，探討S100β對炎癥環(huán)境中嗅鞘細胞的作用機制。
　　結(jié)果：
　　1.采用改良方法原代培養(yǎng)的大鼠嗅鞘細胞純度為82.7%。
　　2.采用LV5載體構(gòu)建的S100β過表達載體平均轉(zhuǎn)染效率為74%。
　　3.采用CCK-8法繪制細胞生長曲線顯示

4、，三組間細胞增殖能力無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　4.在加入INF-γ后6、12和24h，S100β-OECs組的抗凋亡因子Bcl-2表達水平較空載體-OECs組高（P＜0.05），S100β-OECs組的炎癥因子INOS、IL-1β、TNF-α和凋亡因子Bax、Puma表達水平較空載體-OECs組低（P＜0.05）。
　　5.TUNNEL染色結(jié)果顯示，在INF-γ誘導(dǎo)后0、3、6h和12h，兩組TUNNEL陽性細胞數(shù)

5、目無差異（P＞0.05）；在致炎24h后，空載體-OECs組TUNNEL陽性細胞數(shù)目明顯多于S100β-OECs組（P＜0.05）。
　　6.在INF-γ誘導(dǎo)后3h，兩組中S100β表達均上升（P＜0.05），但致炎6h、12h及24h后，兩組中S100β表達均持續(xù)下降（P＜0.05）；同一時間點內(nèi)，S100β-OECs組S100β蛋白表達均高于空載體-OECs組（P＜0.05）。
　　7.空載體-OECs組中NFκB p6

6、5蛋白表達在致炎后3h開始出現(xiàn)上調(diào)（P＜0.05），在6h上調(diào)達到峰值；而S100β-OECs組NFκB p65蛋白表達在致炎后3h出現(xiàn)下調(diào)（P＜0.05），在6h后出現(xiàn)上調(diào)趨勢。致炎后3h、6h、12h后S100β-OECs組NFκB p65蛋白表達水平均明顯低于同一時間點空載體-OECs組（P＜0.05）。
　　8.致炎后3h，兩組中p38蛋白表達水平均出現(xiàn)下調(diào)(P＜0.05)，致炎后6h，空載體-OECs組中p38蛋白表達水

7、平出現(xiàn)上調(diào)并達到頂峰(P＜0.05)。致炎后3h、6h、12h，S100β-OECs組的p38蛋白表達低于空載體-OECs組(P＜0.05)。致炎后不同時間點，兩組中ERK1/2蛋白及P-JNK蛋白均無明顯變化（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.在體外細胞實驗S100β能夠抑制OECs釋放炎癥相關(guān)因子。
　　2.S100β可降低炎癥條件下OECs凋亡率，從而提高其存活率。
　　3.S100β蛋白可能通過介導(dǎo)N