木糖生物合成L-蘋果酸的代謝工程研究.pdf

1、L-蘋果酸是一種天然存在的有機(jī)酸，具有顯著的生理功能，市場(chǎng)發(fā)展空間良好。木糖是一種廣泛存在的生物質(zhì)原料，在木質(zhì)纖維素中含量?jī)H次于葡萄糖。能夠有效利用木糖為底物進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的微生物菌種開發(fā)對(duì)提高木質(zhì)纖維素的資源化利用有顯著的促進(jìn)作用。本論文擬開發(fā)能利用木糖合成蘋果酸的菌株，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　論文首先利用λ-Red重組技術(shù)，對(duì)大腸桿菌內(nèi)源的三羧酸循環(huán)途徑進(jìn)行修改，依次敲除蘋果酸合酶基因maeAB、蘋果酸脫氫酶基因md

2、h和富馬酸合酶基因簇fumA CB，并引入木糖合成乙醇酸途徑，構(gòu)建以木糖為碳源的蘋果酸合成途徑。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著敲除基因的增多，細(xì)菌生長(zhǎng)速率和木糖利用速率逐漸變慢。敲除上述maeAB、mdh和fumACB的MA-05菌株生長(zhǎng)速度最慢，其在搖瓶中培養(yǎng)72h，能積累1.99g/L的L-蘋果酸，同時(shí)消耗4.24g/L的D-木糖，蘋果酸得率為0.47g蘋果酸/g木糖，達(dá)到理論得率的52％。
　　在此基礎(chǔ)上，在MA-05菌株中過(guò)表達(dá)乙醇酸

3、氧化酶基因簇glcDEF和蘋果酸合酶基因glcB、aceB，強(qiáng)化重組菌株的的蘋果酸合成途徑。研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)glcDEF和glcB對(duì)蘋果酸的合成有促進(jìn)作用，而過(guò)表達(dá)aceB會(huì)明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí)過(guò)表達(dá)glcDEF和glcB的MA-10菌株在72h的搖瓶發(fā)酵中，消耗5.22g/L的D-木糖，同時(shí)產(chǎn)生4.53g/L的L-蘋果酸，得率為0.87g蘋果酸/g木糖，達(dá)到理論得率的97％，是目前已知的木糖合成蘋果酸的最高得率。
　　最

4、后，論文對(duì)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，研究了在MA-10菌株中表達(dá)NADH氧化酶基因noxE和過(guò)氧化氫酶基因katE對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和蘋果酸合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，noxE基因的表達(dá)有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，但對(duì)蘋果酸的合成無(wú)促進(jìn)作用。katE基因的過(guò)表達(dá)能顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，并加快L-蘋果酸的合成。過(guò)表達(dá)katE基因的MA-11菌株發(fā)酵72h能積累5.90g/L的L-蘋果酸，相比對(duì)照菌株提高了30％。這表明，過(guò)表達(dá)katE能夠降低代謝過(guò)程中H2O2的