牦牛miR--487b和miR--433對C2C12增殖和分化調(diào)控作用的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、骨骼肌正常發(fā)育是機體維持一系列重要生命活動的基礎(chǔ),而成肌細胞的增殖與分化是骨骼肌發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此研究成肌細胞增殖與分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是發(fā)育生物學(xué)的熱點研究領(lǐng)域。成肌細胞的增殖與分化受到一系列轉(zhuǎn)錄因子以及miRNAs的調(diào)控。miRNAs一類長度為18-22nt的非編碼小RNA,其通過與靶mRNA結(jié)合來下調(diào)靶基因表達,進而參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控。諸多研究表明,miRNAs在骨骼肌發(fā)育過程中起到重要的調(diào)控作用?;趯嶒炇仪捌趯Υ笸笈Lヅ:?/p>

2、成年牦牛背最長肌miRNAs高通量測序,發(fā)現(xiàn)miR-487b和miR-433在牦牛胎牛背最長肌中的表達極顯著高于成年牦牛,推測這兩個miRNAs可能參與調(diào)控骨骼肌的生長發(fā)育。因此本研究將小鼠成肌細胞系(C2C12)作為細胞模型,來探究miR-487b和miR-433在成肌細胞增殖和分化過程中的作用,為進一步完善骨骼肌發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)。
  本研究通過轉(zhuǎn)染miRNA mimics或inhibitor實現(xiàn)miRNAs的過表達或

3、抑制表達,研究牦牛miR-487b和miR-433在C2C12細胞增殖與分化過程中的功能。運用雙熒光素酶報告基因驗證PITX2是miR-487b的直接靶基因,進一步闡明miR-487b在骨骼肌發(fā)育過程中的調(diào)控機制。主要結(jié)果如下:
  (1)克隆測序獲得牦牛miR-487b和miR-433成熟序列,保守性分析發(fā)現(xiàn),miR-487b和miR-433成熟序列在各物種間高度保守。小鼠組織表達譜結(jié)果顯示,miR-487b和miR-433在骨

4、骼肌中表達豐度最高。
  (2)miR-487b和miR-433在C2C12細胞增殖階段表達量逐漸上調(diào)。過表達miR-487b和miR-433后,增殖標記基因PCNA、CCNB1和MKI67mRNA表達量顯著增加,PCNA蛋白表達量也顯著提高。CCK-8法檢測后發(fā)現(xiàn),與對照組相比,過表達miR-487b和miR-433組均能顯著促進細胞增殖。相反,抑制miR-487b和miR-433后,PCNA、CCNB1和MKI67表達量下調(diào),

5、且C2C12細胞增殖活性顯著降低。表明miR-487b、miR-433促進C2C12細胞增殖。
  (3)體外成功構(gòu)建C2C12成肌細胞誘導(dǎo)分化體系,隨著誘導(dǎo)分化時間延長,miR-487b和miR-433表達量呈上升趨勢。過表達miR-487b和miR-433后,分化標志基因MYOD、MYOG、MYHC在mRNA和蛋白水平均顯著降低。相反,抑制miR-487b、miR-433表達后,MYOD、MYOG、MYHC在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上升

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