miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號通路促進胃癌轉(zhuǎn)移和增殖的研究.pdf

1、背景:
　　胃癌是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，其造成患者死亡人數(shù)居所有惡性腫瘤致死人數(shù)的第二位。胃癌一旦發(fā)生便以較快的速度進展，較易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除胃癌組織是目前相對有效的治療方式。但由于胃癌細(xì)胞的高浸潤性和高轉(zhuǎn)移性，對于中晚期胃癌患者而言手術(shù)療效并不令人滿意。因此，在基因水平上進一步闡明胃癌轉(zhuǎn)移的分子機制，有助于胃癌的治療及預(yù)后水平的提高。
　　本研究通過基因芯片技術(shù)，相對于非轉(zhuǎn)移性的胃癌組織在轉(zhuǎn)移性的胃癌組織中

2、篩選出數(shù)百個差異表達基因。進一步分析顯示在26個表達差異最為明顯的基因中包括了GAGE家族中的GAGE12I及GAGE12D等成員。GAGE基因家族可在腫瘤組織和正常睪丸組織中表達，而在其它正常組織中不表達。有報道顯示GAGE基因表達的蛋白產(chǎn)物能夠引起免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，因此其表達的產(chǎn)物又被稱為腫瘤-睪丸抗原。有研究顯示GAGE基因與腫瘤患者較差的臨床預(yù)后相關(guān)，而包括GAGE12I等家族成員在胃癌中的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究的前期實驗

3、提示GAGE12I等家族成員在轉(zhuǎn)移性的胃癌組織中的表達顯著上調(diào)，提示其可能與胃癌的進展特別是與胃癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。GAGE12I對胃癌細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移以及增殖的調(diào)節(jié)作用值得進一步研究。GAGE12I在胃癌中的表達模式能否成為胃癌患者的生物學(xué)標(biāo)記物，以及其異常表達的上游調(diào)節(jié)機制均需要進一步探討。
　　mircoRNAs是一類短鏈且非編碼RNA，它們通過堿基互補的作用方式結(jié)合在靶基因的3’-UTR區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄后的水平抑制靶基因的蛋白表達。

4、在本研究中，通過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)GAGE12I可能受到miR-30C(miR-30C-1-3P和miR-30C-2-3P)，miR-887-5p， miR-320b以及miR-590-3p等多個miRNAs的負(fù)向調(diào)控。這些miRNAs是否真正發(fā)揮對GAGE12I的調(diào)節(jié)作用，以及其是否通過負(fù)向調(diào)控GAGE12I發(fā)揮調(diào)節(jié)胃癌進展也值得深入研究。
　　方法:
　　1.mRNA基因芯片在胃癌組織中檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達基因。收集原發(fā)的胃

5、癌新鮮標(biāo)本，其中未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非轉(zhuǎn)移性胃癌組織及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性胃癌組織各5例，進行mRNA芯片檢測。對轉(zhuǎn)移性胃癌和非轉(zhuǎn)移性胃癌中的基因表達進行對比，按照基因在轉(zhuǎn)移組中表達上調(diào)比值≧2.0或下調(diào)比值≦0.5，并且滿足P≦0.05進行差異基因的初步篩選。
　　2.RT-qPCR檢測基因mRNA及miRNA的表達。將收集的胃癌新鮮組織或是胃癌細(xì)胞樣本，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測各

6、樣本中基因表達情況。對miRNA的檢測，首先使用miRNA提取試劑盒提取石蠟組織中的miRNA，再進行逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR檢測。
　　3.目的基因蛋白表達的檢查。收集132例胃癌石蠟標(biāo)本，免疫組織化學(xué)(IHC)技術(shù)檢測目的蛋白在胃癌組織中的表達情況。在胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GAGE12I過表達載體或miR-30C后，Western-blot檢測相關(guān)目的蛋白相對于對照組的表達情況。
　　4.Transwell檢測胃癌細(xì)胞遷移和浸潤能

7、力。將GAGE12I過表達載體或miRNAs mimics及相應(yīng)的對照載體或mimics轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系，進行Transwell實驗檢測胃癌細(xì)胞的遷移和浸潤能力的改變。
　　5.細(xì)胞增殖和凋亡檢測。將GAGE12I過表達載體或miRNA mimics及相應(yīng)對照轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，通過MTS、EDU及流式細(xì)胞學(xué)實驗檢測胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡能力的改變。
　　6.動物學(xué)實驗。以慢病毒感染的方式在胃癌細(xì)胞系中穩(wěn)定過表達GAGE12I。再將感

8、染后的胃癌細(xì)胞通過皮下和尾靜脈注射的方式注入裸鼠體內(nèi)。5周后與對照組相比，觀察裸鼠皮下成瘤情況和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移的情況。分析GAGE12I對胃癌細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移以及增殖情況的影響。
　　7.mRNA表達譜芯片分析受GAGE12I調(diào)控的信號通路。收集過表達GAGE12I及對照組胃癌細(xì)胞，進行mRNA基因表達譜檢測。分析差異性表達的信號通路，并結(jié)合信號通路的功能篩選可能受GAGE12I調(diào)控的信號通路。并以RT-qPCR和western-b

9、lot實驗驗證受調(diào)控的信號通路。
　　8.ELISA實驗檢測VEGF的表達。收集過表達GAGE12I組及對照組的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒的說明進行ELISA試驗操作，檢測GAGE12I對細(xì)胞外泌VEGF表達的影響。
　　9.miRNA的預(yù)測與驗證。首先通過軟件對可能結(jié)合在GAGE12I-3'UTR區(qū)域的miRNA進行預(yù)測。通過構(gòu)建GAGE12I-3'UTR雙熒光素酶載體，雙熒光素酶實驗驗證miRNA對GAGE12I表達

10、的調(diào)控作用。再進行western-blot實驗進一步驗證miRNA對GAGE12I蛋白表達水平的調(diào)控，從而最終確定能夠直接調(diào)節(jié)GAGE12I的miRNA。
　　10.數(shù)據(jù)分析。兩組數(shù)據(jù)之間的差異采用Student t-test的檢驗方法。Kaplan-Meier和Log-rank檢驗法分析GAGE12I以及miR-30C的表達與胃癌患者術(shù)后生存的關(guān)系。GAGE12I與miR-30C之間的關(guān)系采用Spearman's相關(guān)分析。P＜0

11、.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.基因芯片結(jié)果顯示GAGE12I等GAGE基因家族成員的表達在轉(zhuǎn)移性胃癌組織中顯著上調(diào)?；蛐酒Y(jié)果顯示在轉(zhuǎn)移性的胃癌組中發(fā)現(xiàn)700個顯著下調(diào)的基因和450個顯著上調(diào)的基因。在差異最顯著的26個基因中發(fā)現(xiàn)了GAGE12I及GAGE12D等GAGE家族的基因。
　　2.實驗結(jié)果進一步證實GAGE12I及GAGE12D在轉(zhuǎn)移性胃癌組織中表達上調(diào)。在擴大樣本量的胃癌新鮮組織樣本中進行R

12、T-qPCR驗證，結(jié)果顯示GAGE12I及GAGE12D在轉(zhuǎn)移性胃癌組織樣本中的表達顯著升高，該結(jié)果與基因芯片的結(jié)果一致。IHC結(jié)果顯示GAGE12I蛋白主要在胃癌細(xì)胞的胞核中表達，并且再次證實其在轉(zhuǎn)移性的胃癌組中明顯上調(diào)。
　　3.GAGE12I促進胃癌細(xì)胞的遷移和浸潤。體外實驗結(jié)果顯示:BGC823，AGS及MKN45細(xì)胞的遷移與浸潤能力在過表達GAGE12I后明顯增加。動物學(xué)實驗結(jié)果顯示GAGE12I在動物體內(nèi)明顯促進癌細(xì)胞

13、的局部浸潤與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。
　　4.GAGE12I在動物體內(nèi)促進胃癌細(xì)胞的增殖。體外實驗結(jié)果顯示:GAGE12I在體外對胃癌細(xì)胞的增殖或凋亡能力沒有明顯的影響。然而，動物學(xué)實驗顯示過表達GAGE12I后胃癌細(xì)胞的增殖能力明顯增加，腫瘤的生長速度加快，即GAGE12I在動物體內(nèi)明顯增加胃癌細(xì)胞增殖能力。
　　5.GAGE12I上調(diào)VEGF信號通路活性?；蛐酒Y(jié)果顯示在胃癌細(xì)胞內(nèi)過表達GAGE12I能夠明顯上調(diào)VEGF信號通路

14、的表達。后續(xù)通過RT-qPCR及western-blot等實驗也表明GAGE12I能夠明顯上調(diào)VEGF信號通路的表達，相關(guān)基因如VEGF，Paxillin，P38，pHSP27等表達明顯上調(diào)。
　　6.Snail及E-cad等EMT相關(guān)基因的表達也受GAGE12I的顯著調(diào)控。RT-qPCR及western-blot實驗結(jié)果表明GAGE12I在胃癌細(xì)胞中顯著上調(diào)Snail的表達和下調(diào)E-cad的表達。
　　7.GAGE12I通

15、過上調(diào)VEGF促進胃癌血管新生。ELISA實驗顯示GAGE12I能夠促進胃癌細(xì)胞外泌的VEGF增加，EDU實驗顯示以GAGE12I組胃癌細(xì)胞上清液培養(yǎng)人內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC后，其增殖能力明顯增加。動物學(xué)實驗顯示GAGE12I組的皮下瘤體中CD34陽性(CD34+)的微血管數(shù)量明顯高于對照組。在人胃癌組織中，GAGE12I高表達組中CD34+微血管數(shù)也明顯多于GAGE12I低表達組中CD34+微血管數(shù)。
　　8.GAGE12I受miR

16、-30C的負(fù)向調(diào)控。軟件預(yù)測可能對GAGE12I具有負(fù)向調(diào)控作用的miRNAs，結(jié)合miRNAs相關(guān)功能研究篩選出miR-30C-1-3P，miR-30C-2-3P，miR-887-5p， miR-320b以及miR-590-3p等多個miRNAs。雙熒光素酶實驗顯示miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p能夠明顯抑制GAGE12I的表達;western-blot進一步證實GAGE12I的表達能夠受miR-30c-1-3p及m

17、iR-30c-2-3p的負(fù)向調(diào)控。相關(guān)分析也顯示miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p的表達均與GAGE12I的表達均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　9.GAGE12I及miR-30C的表達與胃癌患者的生存預(yù)后密切相關(guān)。GAGE12I高表達預(yù)示著胃癌患者較差的總體生存率及無瘤生存率，而miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p的高表達則預(yù)示著胃癌患者較高的總體生存率，miR-30c-1-3p高表達還預(yù)示著較高的無瘤生存率

18、。
　　10.miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移和浸潤。 Transwell實驗結(jié)果顯示在胃癌細(xì)胞中過表達miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p均能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移浸潤能力，但對胃癌細(xì)胞的增殖能力無明顯影響。
　　結(jié)論:
　　1.GAGE12I及GAGE12D在轉(zhuǎn)移性胃癌組織中高表達，并且GAGE12I的高表達預(yù)示胃癌患者較差的臨床預(yù)后。
　　2.GA

19、GE12I能夠在體內(nèi)、外明顯提高胃癌細(xì)胞的遷移、浸潤以及轉(zhuǎn)移能力。GAGE12I在體內(nèi)還能夠上調(diào)胃癌增殖和血管新生的能力。
　　3.GAGE12I在胃癌細(xì)胞內(nèi)通過調(diào)節(jié)VEGF信號通路活性及癌細(xì)胞EMT而促進胃癌的進展。
　　4.GAGE12I的表達受miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p的負(fù)向調(diào)控，并且高表達的miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p預(yù)示胃癌患者較好的臨床預(yù)后。
　　5.miR-3