谷氨酸-NMDA1、Shh介導(dǎo)的成體NSC增殖分化信號(hào)通路的研究.pdf

1、背景：近年來(lái)，損傷腦組織的修復(fù)一直是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞(NSC: Neural Stem Cells)的增殖與分化，為損傷腦組織的修復(fù)提供了新的理論基礎(chǔ)和思路。腦梗死及腦組織缺血損傷后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而使大量谷氨酸(glutamic acid)外流，引起局部谷氨酸升高。雖然濃度升高的谷氨酸對(duì)組織有毒害作用，但是一定濃度的谷氨酸卻可以促進(jìn)NSC的增殖與分化。隨著研究的不斷深入，我們發(fā)現(xiàn)谷氨酸是通過(guò)其

2、受體及Shh(sonic hedgehog)信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)NSC的增殖和分化。和以往的細(xì)胞學(xué)角度的研究相比，近年來(lái)不斷進(jìn)步與完善的分子生物學(xué)技術(shù)為我們提供新的研究方法和思路。在本文中，我們從分子層面深入地對(duì)谷氨酸及其受體及Shh（sonic hedgehog）信號(hào)通路介導(dǎo)的NSC的增殖和分化進(jìn)行了研究。
　　目的：體外培養(yǎng)3日齡SD大鼠海馬區(qū)原代神經(jīng)干細(xì)胞，并使用傳代三代以上神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)篩選目的基因最適濃度，向三代神經(jīng)干細(xì)胞中加入

3、目的基因，上調(diào)和沉默Shh基因后觀(guān)察神經(jīng)干細(xì)胞中谷氨酸刺激下Nesting的表達(dá)，Shh信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響，同時(shí)阻斷上游谷氨酸NMDA受體后，在谷氨酸刺激下，神經(jīng)干細(xì)胞中Shh、Nestin mRNA及蛋白的表達(dá)變化情況及其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)增殖力的影響。
　　方法：1、在大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中添加5uM的谷氨酸進(jìn)行刺激，通過(guò)熒光定量PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中基因Shh的mRNA及蛋白表達(dá)量;

4、
　　2、采用Shh-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性NSC添加5uM谷氨酸刺激，通過(guò)熒光定量PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中基因Shh和Nestin的mRNA及蛋白表達(dá)量;
　　3、在大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中通過(guò)谷氨酸受體阻斷劑Conantokin-R阻斷谷氨酸受體NMDAR1，添加5uM谷氨酸刺激，通過(guò)熒光定量PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中基因Shh和Nestin的

5、mRNA及蛋白表達(dá)量;
　　結(jié)果：1、因Shh-shRNA質(zhì)粒上具有綠色熒光蛋白(eGFP)基因，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)在熒光顯微鏡觀(guān)察，轉(zhuǎn)染后有少量陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白，被激發(fā)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。嘌呤霉素篩選48小時(shí)大部分未轉(zhuǎn)染Shh-shRNA質(zhì)粒的細(xì)胞死亡，大量存活細(xì)胞為成共轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞.
　　2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Shh、Nestin檢測(cè)擴(kuò)增曲線(xiàn)及熔解曲線(xiàn)均良好，無(wú)非特異性擴(kuò)增。正常培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞Shh

6、、Nestin為參照，5uM谷氨酸組Shh、Nestin表達(dá)均明顯增加(P＜0.05);Conantokin-R組Shh、Nastin mRNA表達(dá)均未見(jiàn)明顯增加(P＞0.05); Shh-shRNA組Shh mRNA表達(dá)明顯受到抑制(P＜0.05），Nestin表達(dá)未受到明顯影響(P＞0.05);NC-shRNA組Shh、Nestin表達(dá)均明顯增加（P＜0.05）。
　　3、蛋白印跡結(jié)果表明，相對(duì)于正常培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，5uM谷

7、氨酸組Shh、Nestin蛋白表達(dá)均明顯增加(P＜0.05); Conantokin-R組Shh、Nestin蛋白表達(dá)均未見(jiàn)明顯增加(P＞0.05); Shh-shRNA組Shh蛋白表達(dá)明顯受到抑制(P＜0.05），Nestin蛋白表達(dá)未受到明顯影響(P＞0.05);NC-shRNA組Shh、Nestin蛋白表達(dá)均明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論：Shh信號(hào)通路及NMDA受體在神經(jīng)干細(xì)胞的增值過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，谷氨酸可以通