硫酸黏菌誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、黏菌素又名多黏菌素E，是由多黏芽孢桿菌培養(yǎng)液中提取的堿性環(huán)狀多肽類抗生素，臨床上常用其硫酸鹽，但因其具有腎毒性和神經(jīng)毒性使黏菌素的應(yīng)用受到很大限制。近年來，由于多重耐藥菌的肆虐及對抗多重耐藥菌的新藥研發(fā)有限，而硫酸黏菌素對多重耐藥革蘭氏陰性桿菌療效顯著，使其又重新得到重視，并在臨床應(yīng)用。但因神經(jīng)毒性和腎毒性問題仍然存在，所以明確其毒性機(jī)制為尋找新的減毒措施，指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要意義。利用體外系統(tǒng)檢測神經(jīng)毒性是一種趨勢，在體外用于檢測

2、潛在的神經(jīng)毒性和毒性機(jī)制研究的模型很多，尤其是大鼠腎上腺嗜鉻骨髓瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞）被廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)毒理學(xué)的研究。因此本文選用PC12細(xì)胞作為研究對象，結(jié)合小鼠急性毒性試驗(yàn)選擇劑量，初步探討硫酸黏菌素誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能的發(fā)生機(jī)制。
　　 采用寇氏法對18～22g昆明小鼠進(jìn)行硫酸黏菌素尾靜脈注射的急性毒性試驗(yàn)，觀察急性毒性對血常規(guī)、血生化指標(biāo)以及肝腎等器官的影響。根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇有中毒癥狀，但與對照組相比，

3、血常規(guī)和血生化指標(biāo)、肝腎組織結(jié)構(gòu)無顯著性差異的劑量(1 mg·mL-1硫酸黏菌素)，作為體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的最高劑量。再結(jié)合細(xì)胞活力測定(MTT)試驗(yàn)，AO/EB雙熒光染色、Hoechst33258染色、透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)、LDH水平檢測、ROS含量測定，篩選出250、125、62.5μg·mL-1硫酸黏菌素用于后續(xù)試驗(yàn)。羅丹明123染色流式細(xì)胞儀觀察線粒體膜電位的變化及PI單染檢測細(xì)胞凋亡周期，試劑盒法測定caspase-3、casp

4、ase-9的活性、DNALadder法檢測DNA片段等方面觀察硫酸黏菌素誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡情況。檢測細(xì)胞內(nèi)、外游離Ca2+濃度變化，Western-blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素C、Fas、FasL、GnRP78、caspase-3、caspase-8、caspase-9和caspase-12的表達(dá)，實(shí)時定量PCR染料法檢測凋亡相關(guān)基因caspase-3、caspase-8、caspase-9、casp

5、ase-12的表達(dá)，從誘導(dǎo)凋亡的三條經(jīng)典信號途徑推導(dǎo)出硫酸黏菌素誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 (1) MTT、LDH試驗(yàn)證明硫酸黏菌素對PC12細(xì)胞有強(qiáng)烈的毒性，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率降低，LDH釋放隨時間和劑量的增加而升高。
　　 (2)通過倒置顯微鏡、熒光顯微鏡和透射電鏡的觀察發(fā)現(xiàn)125、250μg·mL-1硫酸黏菌素可引起PC12細(xì)胞突起變短，胞漿內(nèi)有空泡形成，細(xì)胞核固縮，核碎片增多，線粒體腫脹、并伴

6、有空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體釋放等典型的凋亡特征出現(xiàn)且具有劑量依賴性關(guān)系。
　　 (3)硫酸黏菌素能使ROS活性升高，破壞機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，造成PC12細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，并且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間-效應(yīng)關(guān)系，說明氧化應(yīng)激可能是硫酸黏菌素的神經(jīng)毒性機(jī)制之一。
　　 (4)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)125、250μg·mL-1硫酸黏菌素能降低線粒體膜電位，干擾DNA正常合成過程，造成細(xì)胞在S期阻滯，引起DNA鏈斷裂，由此啟

7、動了以劑量依賴關(guān)系誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡程序。
　　 (5) DNA Ladder檢測、caspase-3、caspase-9活性變化等結(jié)果顯示，125、250μg·mL-1劑量組硫酸黏菌素可引起DNA鏈斷裂，導(dǎo)致DNA損傷，引起caspase-3、caspase-9活化程度顯著增強(qiáng)，并有劑量、時間依賴關(guān)系。
　　 (6)通過Western-blot法發(fā)現(xiàn)125、250μg·mL-1硫酸黏菌素能使p53、細(xì)胞色素C、Ba

8、x、caspase-9和caspase-3表達(dá)顯著增加，Bcl-2表達(dá)顯著減少，說明硫酸黏菌素通過損傷細(xì)胞DNA誘導(dǎo)并激活p53，并進(jìn)一步引起B(yǎng)ax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值升高，細(xì)胞色素C等促凋亡物質(zhì)釋放入胞質(zhì)，引起caspase-9的釋放，最后激活caspase-3通過線粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 (7)通過Western-blot法觀察到125、250μg·mL-1硫酸黏菌素能使PC1

9、2細(xì)胞中Fas、FasL、caspase8表達(dá)顯著增加，說明硫酸黏菌素引起Fas、FasL受體表達(dá)增加，導(dǎo)致caspase-8釋放增加，最后激活caspase-3，通過死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 (8)125、250μg·mL-1硫酸黏菌素能使PC12細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中[Ca2+]i濃度降低，使鈣穩(wěn)態(tài)被破壞，Western-blot法顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GnRP78表達(dá)增多，caspase-12

10、釋放增加，最后也激活caspase-3，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 (9)通過實(shí)時熒光定量PCR方法檢測PC12細(xì)胞中caspase-8、caspase-9、caspase-12基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)硫酸黏菌素誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡主要由死亡受體途徑引起，接下來是線粒體途徑，最后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是。
　　 綜上所述，高濃度的硫酸黏菌素在體外能夠?qū)е翽C12細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，并導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過死亡受