EN2基因沉默對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：探討沉默EN2對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞株）生物學(xué)行為的影響。
　　方法：利用慢病毒載體介導(dǎo)沉默人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞株EN2基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定低表達(dá)EN2基因的人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞株，以Lv-shEN2為實(shí)驗(yàn)組、Lv-shcon為空載組、control為空白對(duì)照組。RT-qPCR和Western blot分別檢測(cè)EN2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，MTT檢測(cè)HK-2細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞

2、周期和凋亡，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。
　　結(jié)果：設(shè)計(jì)與EN2互補(bǔ)的DNA序列，合成shRNA-EN2并克隆到慢病毒載體，同時(shí)設(shè)計(jì)非特異性shRNA生成的載體作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后，篩選獲得穩(wěn)定低表達(dá)EN2基因的HK-2細(xì)胞株。RT-qPCR分析顯示 EN2mRNA在 Lv-shcon組2(-ΔΔCt)=1.07±0.07,control組2(-ΔΔCt)=1±0.14中的表達(dá)

3、分別是 Lv-shEN2組2(-ΔΔCt)=0.58±0.02的1.9倍和1.7倍。Western Blot檢測(cè)各組灰度值Lv-shEN2組2576.65。Lv-shcon組1619.26，control組1478.85。提示轉(zhuǎn)染成功。
　　MTT法分析結(jié)果采用單因素方差分析顯示三組細(xì)胞OD值差別（F=4.78。P=0.01）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與兩對(duì)照組細(xì)胞比較，Lv-shEN2組細(xì)胞OD值升高，提示抑制EN2蛋白可促進(jìn)人腎小管上皮細(xì)

4、胞HK-2細(xì)胞的增殖活性。
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示Lv-shEN2組相對(duì)于兩對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率下降。Lv-shEN2實(shí)驗(yàn)組、Lv-shcon空載組、control空白對(duì)照組HK-2細(xì)胞凋亡比例分別為9.79％，24.98%和24.9%。與兩對(duì)照組細(xì)胞比較，Lv-shEN2組細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率均下降，提示抑制EN2基因表達(dá)可減少HK-2細(xì)胞凋亡。
　　細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)顯示Lv-shEN2實(shí)驗(yàn)組、Lv-shcon空載組、co

5、ntrol空白對(duì)照組HK-2細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別為18.5±5.62，0.5±1.12和0.5±0.76，單因素方差分析顯示Lv-shEN2實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)與兩對(duì)照組之間不同（F=19.35。P=0.00），說(shuō)明下調(diào)EN2蛋白可提高人腎小管上皮細(xì)胞HK-2的侵襲能力。
　　細(xì)胞劃痕試驗(yàn)各組0h，6h，12h和24h劃痕寬度采用單因素方差分析，結(jié)果顯示各組細(xì)胞遷移能力差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：下調(diào)HK-2細(xì)胞