杜氏鹽藻鞭毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍譏FT88基因的克隆及功能分析.pdf

1、杜氏鹽藻是一種高度耐鹽的單細(xì)胞真核生物，有一對約13μm的等長雙鞭毛，其具有典型的“9+2”結(jié)構(gòu)，利用普通的理化手段即可調(diào)節(jié)鞭毛的再生和解聚。與模式生物萊茵衣藻相比，杜氏鹽藻無細(xì)胞壁，結(jié)構(gòu)上更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞，且其結(jié)構(gòu)簡單，生長周期短易于培養(yǎng)，鞭毛形態(tài)及結(jié)構(gòu)易于觀察，所以非常適合作為研究鞭毛/纖毛長度調(diào)控機(jī)制的模式生物。
　　 鞭毛和纖毛是進(jìn)化上保守的普遍存在于多種細(xì)胞表面的細(xì)胞器，它們的結(jié)構(gòu)基本相同。鞭毛/纖毛內(nèi)運(yùn)輸是定位在鞭

2、毛/纖毛膜和軸絲之間的一種基于微管的運(yùn)輸機(jī)制。很多鞭毛/纖毛相關(guān)蛋白顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)由驅(qū)動(dòng)蛋白Ⅱ所驅(qū)動(dòng)的鞭毛底部到頂端的運(yùn)輸（即正向運(yùn)輸）和由動(dòng)力蛋白所驅(qū)動(dòng)的從鞭毛頂端到底端的運(yùn)輸（即逆向運(yùn)輸）。IFT蛋白（intraflagellartransportprotein）對于真核細(xì)胞鞭毛/纖毛的裝配和維護(hù)是必不可少的。
　　 IFT復(fù)合體包含20種以上IFT蛋白，可分為IFT-A和IFT-B。IFT88蛋白是IFT-B的成分之一，它是

3、由IFT88基因所編碼的，該基因?qū)儆?tetratricopeptiderepeat，TPR)多肽重復(fù)序列家族成員，此重復(fù)序列能介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用[1]，對IFT88蛋白的運(yùn)輸功能起著極其重要的作用。在衣藻細(xì)胞內(nèi)，IFT88能夠與IFT52，IFT46和Hsp40相互作用，IFT88基因的缺失會(huì)導(dǎo)致鞭毛組裝缺陷。在小鼠中，IFT88同源蛋白Tg737的突變會(huì)引起多囊腎疾病[2]，且Tg737的突變與小鼠的視覺、嗅覺的功能障礙也有一

4、定關(guān)系[3-4]。
　　 由于IFT88在鞭毛組裝中的重要的作用，IFT蛋白在綠色藻類，線蟲類和脊椎動(dòng)物中都非常保守，并且IFT88在鹽藻中的功能未見報(bào)道。本試驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室鹽藻鞭毛再生過程中的轉(zhuǎn)錄組測序片段（共591個(gè)核苷酸，在NCBI比對與衣藻IFT88mRNA片段有71％的同源性），通過3’和5'RACE擴(kuò)增得到其cDNA全長，使用機(jī)械研磨法去除鹽藻鞭毛后使鹽藻鞭毛再生，分別用碘染[5-6]和銀染[7]方法觀察杜氏鹽藻鞭毛的

5、再生情況，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了IFT88mRNA在鞭毛再生過程中的表達(dá)情況。隨后利用ORFfinder預(yù)測并擴(kuò)增其開放閱讀框（OpenReadingFrame，ORF），構(gòu)建了IFT88的原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)其在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)。本試驗(yàn)利用鹽藻作為模式生物來研究IFT88的功能，為進(jìn)一步研究IFT88在細(xì)胞內(nèi)的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.杜氏鹽藻IFT88基因全長的克隆
　　

6、根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室鹽藻轉(zhuǎn)錄組測序片段（共591個(gè)核苷酸，在NCBI比對與衣藻有71％的同源性），分別設(shè)計(jì)其3'內(nèi)、外測引物及5'端內(nèi)、外側(cè)引物，3'RACE法，5'端PCR法擴(kuò)增IFT88的cDNA序列，測序后使用DNAMAN拼接，最后驗(yàn)證所得序列。
　　 2.杜氏鹽藻IFT88的功能分析
　　 使用機(jī)械研磨法處理杜氏鹽藻，使其脫去鞭毛，正常培養(yǎng)，使鞭毛發(fā)生再生，并分別用銀染和碘染方法觀察杜氏鹽藻鞭毛。同時(shí)在再生過程中提取部分

7、時(shí)間點(diǎn)杜氏鹽藻總RNA;分別將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)一對引物，以GAPDH基因作為內(nèi)參，以反轉(zhuǎn)錄的杜氏鹽藻cDNA作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，在轉(zhuǎn)錄水平上研究杜氏鹽藻IFT88基因在鞭毛再生過程中相對表達(dá)量的變化。
　　 3.杜氏鹽藻IFT88蛋白的原核表達(dá)
　　 將杜氏鹽藻IFT88基因開放閱讀框與原核表達(dá)載體pET28a(+)連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3

8、)，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測IFT88蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.杜氏鹽藻IFT88基因全長的克隆
　　 克隆得到杜氏鹽藻IFT88基因全長為3054bp，其中包括316bp的5'UTR、428bp的3'UTR以及2400bp的開放閱讀框，共編碼799個(gè)氨基酸殘基。蛋白序列與多個(gè)物種的IFT88具有很高的同源性，其中與萊茵衣藻IFT88基因的同源性約為59％

9、。
　　 2.杜氏鹽藻IFT88的功能分析
　　 通過碘染和銀染對鹽藻染色，在顯微鏡下觀察到鹽藻鞭毛再生過程中鞭毛長度的變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示杜氏鹽藻IFT88mRNA的表達(dá)量在去鞭毛后30min左右時(shí)最高。與鞭毛生長速率基本一致。證明IFT88在杜氏鹽藻鞭毛的再生過程可能起著非常重要的作用。
　　 3.杜氏鹽藻IFT88蛋白的原核表達(dá)
　　 聚丙烯凝膠電泳結(jié)果顯示:與對照組相比，誘導(dǎo)組在90k

10、Da左右有特異性條帶出現(xiàn)，與預(yù)測的IFT88蛋白大小相同。
　　 結(jié)論:
　　 1.克隆拼接得到杜氏鹽藻IFT88基因全長為3054bp，其中包括316bp的5'UTR、428bp的3'UTR以及2400bp的開放閱讀框，共編碼799個(gè)氨基酸殘基。
　　 2.IFT88在杜氏鹽藻鞭毛的再生30min時(shí)表達(dá)量增加，說明其在鞭毛再生過程中可能起著非常重要的作用。
　　 3.成功誘導(dǎo)了IFT88在大腸桿菌中的表