TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域-人FOXP3相關(guān)融合蛋白的制備及其生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、FOXP3是FOX(forkhead box)家族轉(zhuǎn)錄因子中的一員，是Treg細(xì)胞(Treg)的相對特異性標(biāo)志，同時(shí)對Treg的發(fā)生、發(fā)育、功能的維持與發(fā)揮方面起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)染表達(dá)外源性人FOXP3（hFOXP3）或鼠Foxp3（mFoxp3）可使非Treg細(xì)胞具有類似Treg細(xì)胞樣的表型及抑制Jurkat T細(xì)胞增殖功能。
　　 人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因編碼的反式激活蛋白（TAT）中的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(

2、PTD)能夠高效、快速地?cái)y帶外源性蛋白穿入幾乎所有的真核細(xì)胞，而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。由于其具有核定位信號(NLS)，因此也能定位于細(xì)胞核內(nèi)。同時(shí)PTD具有不影響其攜帶的目的蛋白功能的特點(diǎn)。
　　 目的：研究PTD-hFOXP3、PTD-eGFP-△E251 hFOXP3、PTD-eGFPhFOXP3融合蛋白對T細(xì)胞活化、增殖及其免疫調(diào)節(jié)功能的影響，為最終應(yīng)用于器官移植和自身免疫性疾病治療藥物奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：利用基因重組和

3、定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建pET28a-PTD-hFOXP3、pET28a-PTD-eGFP-△E251 hFOXP3、pET28a-PTD-eGFP-hFOXP3原核表達(dá)載體，并在大腸埃希菌Rosetta(DE3)中表達(dá)融合蛋白，經(jīng)Ni2+-IMAC親和柱純化融合蛋白和脫鹽柱除鹽獲得純化蛋白。Western-blot技術(shù)檢測融合蛋白表達(dá)的正確性，流式細(xì)胞術(shù)檢測融合蛋白穿越細(xì)胞膜進(jìn)入人急性白血病T淋巴細(xì)胞瘤株JurkatT細(xì)胞中的能力和量效關(guān)系，

4、Western-blot分析和共聚焦顯微鏡觀察確認(rèn)融合蛋白細(xì)胞內(nèi)定位。通過淋巴細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)初步分析融合蛋白對T細(xì)胞活化增殖的影響。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了pET28a-PTD-hFOXP3、pET28a-PTD-eGFP-△E251 hFOXP3、pET28a-PTD-eGFP-hFOXP3融合蛋白表達(dá)載體，表達(dá)并純化了人PTD-hFOXP3、PTD-eGFP-△E251 hFOXP3、PTD-eGFP-hFOXP3融合蛋白

5、。通過流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)表達(dá)的融合蛋白均能高效的轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，且發(fā)現(xiàn)融合蛋白在640nM，與細(xì)胞共育2h時(shí)蛋白穿入細(xì)胞的效率最高；經(jīng)western-blot檢測和共聚焦顯微鏡觀察確認(rèn)融合蛋白能夠進(jìn)入細(xì)胞漿和細(xì)胞核；同時(shí)經(jīng)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)證明PTD-hFOXP3和PTD-eGFP-hFOXP3融合蛋白能明顯抑制Jurkat T細(xì)胞的活化增殖能力。
　　 結(jié)論：成功表達(dá)具有生物學(xué)活性的PTD-hFOXP3、PTD-eGFP-△E251