弓形蟲多表位抗原ELISA的建立及規(guī)模化豬場(chǎng)弓形蟲病的防控措施研究.pdf

1、弓形蟲是一種全球范圍廣泛流行的人畜共患的寄生原蟲,全球約有1/5的人感染弓形蟲病,孕婦感染弓形蟲病可導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎和死胎,對(duì)免疫抑制和器官移植病人有致命的危險(xiǎn)。弓形蟲感染豬后不僅可以導(dǎo)致母豬的流產(chǎn)、豬群的發(fā)病,被包囊污染的豬肉也是人類感染弓形蟲的主要因素。目前沒有有效的疫苗預(yù)防弓形蟲的感染,所以弓形蟲的防治主要依賴藥物治療,而藥物的長(zhǎng)期不規(guī)范使用導(dǎo)致了抗藥性弓形蟲蟲株的產(chǎn)生,抗藥性的出現(xiàn)增加了規(guī)?；B(yǎng)殖弓形蟲病防控的難度。由于弓形蟲復(fù)雜

2、的生活史,用單一抗原包被的ELISA板不能檢測(cè)到每個(gè)感染階段的抗體。
　　 本試驗(yàn)選擇了弓形蟲已報(bào)道的SAG1、GRA1、ROP2、GRA4和MIC3等多個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原,將它們的抗原表位拼接形成多表位抗原(multiepitope antigenic gene,MAG),DNAstar分析其有很好的抗原活性。構(gòu)建pGEX-KG-MAG重組表達(dá)質(zhì)粒并在E.coli BL21-CodonPlus中穩(wěn)定表達(dá),優(yōu)化了最佳的表達(dá)條件,West

3、ern—blot驗(yàn)證MAG具有免疫活性。用MAG作為抗原建立MAG-ELISA方法,檢測(cè)其它5種常見豬病的陽(yáng)性血清都為陰性；批間和批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10％；在4℃可以保存6個(gè)月以上；用MAG-ELISA檢測(cè)797份臨床豬血清,檢出率比AG-ELISA高3.0％,說明這種檢測(cè)方法有較好的敏感性、特異性及較長(zhǎng)的保質(zhì)期。
　　 收集來源于全國(guó)不同地區(qū)的弓形蟲陽(yáng)性樣品,擴(kuò)增DHPS,DHFR和Cytb基因并測(cè)序,驗(yàn)證國(guó)內(nèi)是否

4、存在抗藥性的弓形蟲蟲株。結(jié)果在20份不同的樣品中并沒有發(fā)現(xiàn)抗藥性的突變,這說明已知的抗藥性蟲株在國(guó)內(nèi)并沒有普遍流行。
　　 從2008年6月到2009年8月對(duì)湖北和河南兩省的15個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行弓形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查,陽(yáng)性率為24.5％。按照弓形蟲抗體陽(yáng)性率的不同將規(guī)模化豬場(chǎng)分為三類:高度流行(陽(yáng)性率>30％)、中等程度流行(15％<陽(yáng)性率<30％)和輕度流行(陽(yáng)性率<15％),并采用不同的防控方案。方案實(shí)施一年后三種豬場(chǎng)的弓形

5、蟲抗體陽(yáng)性率分別由33.1％降低到23.8％、23.3％降為13.0％、12.6％降為9.7％,由此可以看出防控方案的效果比較理想。在方案實(shí)施的同時(shí)還監(jiān)測(cè)了一個(gè)豬場(chǎng)豬瘟抗體的變化,弓形蟲抗體陽(yáng)性率由36.9％降為23.1％,但豬瘟抗體的陽(yáng)性率由65.9％升高到77.6％,這說明弓形蟲的防控對(duì)豬場(chǎng)的免疫效果也有促進(jìn)作用。
　　 本研究建立的MAG-ELISA方法,解決了目前單一抗原檢測(cè)弓形蟲抗體敏感性低的問題。對(duì)國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的弓形