非諾貝特對(duì)小鼠心肌能量代謝相關(guān)基因作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome Proliferator-activated Receptorα,PPARα)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,屬于細(xì)胞核受體超家族,其功能是作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)。PPAR家族在細(xì)胞分化、發(fā)育和代謝方面具有重要作用并且在脂肪酸的攝取和氧化中起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。PPARγ轉(zhuǎn)錄輔助因子1(PGC-1)家族基因PGC-1α和PGC-1β與線粒體生物合成和體內(nèi)能量

2、代謝密切相關(guān)。PPARα激動(dòng)劑非諾貝特(Fenofibrate)是臨床治療用于降血脂的藥物,可以治療高血脂或Ⅱ型糖尿病所引起的脂質(zhì)代謝紊亂。其作用機(jī)理是通過(guò)抑制極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的生產(chǎn)同時(shí)加速其分解代謝,從而降低極低密度脂蛋白、膽固醇和甘油三酯含量,為了進(jìn)一步了解其在代謝方面的作用,我們研究了PPARα激動(dòng)劑非諾貝特對(duì)小鼠心室細(xì)胞線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)的影響。首先非諾貝特處理小鼠,然后提取心室RNA并檢測(cè)核呼吸因子,線粒體外膜

3、蛋白40,硫辛酸合成酶,細(xì)胞色素b,中鏈脂酰輔酶A脫氫酶和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體共活化物的mRNA表達(dá)水平,同時(shí)分析非諾貝特對(duì)小鼠心室脂肪含量的影響,上述研究探討了非諾貝特對(duì)小鼠心臟能量代謝的作用。
　　 貝特類藥物還可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)于胰島素的敏感性,在緩解糖尿病以及由此引發(fā)的心血管疾病方面有重要作用。本課題組在研究非諾貝特受體PPARα對(duì)葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)現(xiàn):在胰島素刺激下,PPARα及其相互作用蛋白一轉(zhuǎn)錄因子GATA6

4、都促進(jìn)葡萄糖消耗和提高檸檬酸合酶活性,但同時(shí)100nM的胰島素又促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步探討非諾貝特-PPARa-GATA6-胰島素-能量代謝-細(xì)胞增殖與凋亡之間的聯(lián)系,我們以能誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的小鼠畸胎瘤細(xì)胞P19CL6為靶細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PPARα和GATA6的細(xì)胞系,研究不同濃度胰島素對(duì)P19CL6細(xì)胞及PPARα和GATA6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系增殖和凋亡的影響,探討不同濃度胰島素對(duì)P19CL6細(xì)胞影響的作用機(jī)制并研究其與細(xì)胞代謝之間的

5、關(guān)系。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在研究PPARα激動(dòng)劑非諾貝特對(duì)小鼠心室細(xì)胞線粒體功能有關(guān)的基因表達(dá)的影響。檢測(cè)非諾貝特處理后,核呼吸因子,線粒體外膜蛋白40,硫辛酸合成酶,細(xì)胞色素b,中鏈脂酰輔酶A脫氫酶和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體共活化物的mRNA表達(dá)水平。并觀察非諾貝特對(duì)小鼠心室脂肪含量的影響,探討非諾貝特與小鼠心臟能量代謝的關(guān)系。此外,我們還探討了另一種與非諾貝特作用機(jī)制密切相關(guān)的藥物胰島素對(duì)P19CL6細(xì)胞

6、的作用,旨在研究胰島素對(duì)P19CL6細(xì)胞的作用機(jī)制及與細(xì)胞代謝之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.8周齡昆明種小鼠,隨機(jī)分為3組:組1,對(duì)照組;組2,非諾貝特處理7天組;組3,非諾貝特處理14天組。每組包含6-8只小鼠。非諾貝特組給予非諾貝特(100mg/kg/day)灌胃7天或14天。對(duì)照組給予羧甲基纖維素鈉混懸液灌胃14天。7天或14天以后,處死小鼠,提取心室組織RNA,經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄后,Q-PCR方法檢測(cè)小鼠心室中N

7、RF-1,Tom40,Lias,cytochromc b,MCAD和PGC-1α這些基因的mRNA表達(dá)情況。另一批同樣處理的小鼠,采用改良的Bligh&Dyer方法提取心室中脂肪,并用甘油三酯定量試劑盒測(cè)定其含量。
　　 2.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并經(jīng)過(guò)G418篩選后,得到穩(wěn)定表達(dá)PPARα和Gata6的細(xì)胞系。
　　 3.胰島素對(duì)P19CL6正常細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的增殖和凋亡研究:正常細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度的胰島素處理。

8、胰島素的濃度分別為:0、10、50、100nmol/L。處理時(shí)間為24h,采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度胰島素對(duì)細(xì)胞增殖的影響。DAPI染色檢測(cè)不同濃度胰島素處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。流式紐胞術(shù)PI單染檢測(cè)胰島素處理后對(duì)細(xì)胞周期的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.非諾貝特處理7天后,小鼠心室中NRF-1-L和NRF-1-S mRNA水平與對(duì)照組相比都有所下降,其中NRF-1-L mRNA下降22％,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義(p＜0.05)。非諾貝特處理14天后,NRF-1-L mRNA水平下降16%,同時(shí),NRF-1-S mRNA水平上升15%。
　　 2.非諾貝特處理7天或者14天后,小鼠心室中Lias mRNA水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。非諾貝特處理7天后,Tom40 mRNA水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異;非諾貝特處理14天后,Tom40 mRNA水平與對(duì)照組相比增加15%。
　　 3.非諾貝特處理7天或者14天后,小鼠心室中cy

10、tochromc b和MCAD mRNA水平都有所增加。非諾貝特處理14天后,cytochrome b和MCAD mRNA水平分別增加31%和32%,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 4.非諾貝特處理7天后,PGC-1α mRNA水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。非諾貝特處理14天后,PGC-1α mRNA水平下降31%,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 5.非諾貝特處理7天后,小鼠心室中脂

11、肪含量無(wú)明顯改變,非諾貝特處理14天后,其脂肪含量與對(duì)照組相比顯著增加。
　　 6.MTT結(jié)果顯示:低濃度胰島素對(duì)P19CL6細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用(P＜0.05),中濃度胰島素對(duì)P19CL6細(xì)胞增殖無(wú)顯著作用,高濃度胰島素對(duì)P19CL6細(xì)胞增殖有顯著抑制作用(P＜0.01)。同樣,低濃度胰島素對(duì)PPARα和GATA6穩(wěn)轉(zhuǎn)P19CL6細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用(P＜0.05),中濃度胰島素對(duì)PPARα和GATA6穩(wěn)轉(zhuǎn)P19CL6細(xì)胞

12、增殖無(wú)顯著作用,高濃度胰島素對(duì)PPARα和GATA6穩(wěn)轉(zhuǎn)P19CL6細(xì)胞增殖有顯著抑制作用(P＜0.01)。
　　 7.DAPI染色結(jié)果顯示:control組的P19CL6細(xì)胞,細(xì)胞核呈現(xiàn)出均勻彌散熒光,細(xì)胞核周邊光滑,完整;10nM組與對(duì)照組相比,細(xì)胞核形態(tài)無(wú)明顯改變;50nM組與對(duì)照組相比,細(xì)胞數(shù)量減少,但細(xì)胞核形態(tài)無(wú)明顯改變;100nM組與對(duì)照組相比,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,且出現(xiàn)凋亡核,表現(xiàn)為核固縮,核碎裂和凋亡小體。PPAR

13、α和GATA6穩(wěn)轉(zhuǎn)P19CL6細(xì)胞形態(tài)也是如此。
　　 8.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:低濃度胰島素處理下的P19CL6細(xì)胞,G1期細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),S期細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。GATA6和PPARα穩(wěn)轉(zhuǎn)P19CL6細(xì)胞用低濃度胰島素處理后,S期細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.05)。中濃度和高濃度胰島素處理下的P19CL6細(xì)胞及PPARα和GATA6穩(wěn)轉(zhuǎn)P19CL6細(xì)胞,S期細(xì)胞數(shù)量與對(duì)