CYP3A4-1G對HepG2細胞CYP3A4基因表達的調控作用及機制.pdf

1、背景與目的：
　　大多數藥物經 CYP450酶代謝。CYP酶基因的變異可導致藥物不良反應，這成為影響藥物安全及患者依從性的主要原因之一。CYP3A4是CYP3A亞家族中最主要的成員之一，占P450酶系總量的30％～40％，主要分布在肝臟和腸道。CYP3A4*1G（G>A，rs2242480）是CYP3A4內含子10中的一個單核苷酸多態(tài)性（SNP），其等位基因頻率在不同民族人群中存在明顯差異。這個等位基因在高加索人群中少見，但在亞洲

2、人群基因頻率超過20%。體內研究表明CYP3A4*1G基因多態(tài)性與他克莫司、阿托伐他汀、芬太尼等藥物的劑量、療效及藥動學改變有關。本課題組前期用雙熒光素酶報告基因技術發(fā)現在 HepG2細胞中，CYP3A4內含子10具有受CYP3A4*1G等位基因調控的增強子與啟動子活性，并發(fā)現 CYP3A4*1G位點附近存在抑制性作用元件。但 CYP3A4*1G及其調控的CYP3A4內含子10與CYP3A4基因表達之間的關系尚不清楚。本研究的目的是探究

3、CYP3A4內含子10及CYP3A4*1G對HepG2細胞CYP3A4表達的影響?；虮磉_可由轉錄因子復合物調控。具有啟動子和增強子活性的CYP3A4內含子10與某些轉錄因子結合，進而調控CYP3A4基因的表達。因此本研究的另一目的是探討與 CYP3A4*1G及其側翼序列相結合的轉錄因子，為從內含子 SNP調控基因表達角度解釋CYP3A4酶活性的個體差異提供分子機制，進而為臨床個體化用藥和與用藥相關的法醫(yī)學鑒定提供理論基礎。
　　

4、方法：
　　構建一系列真核表達載體，轉染入HepG2細胞，培養(yǎng)48h后，qPCR檢測CYP3A4 mRNA水平，分別對其進行啟動子功能分析（陰性對照組、陽性對照Ⅰ組、野生啟動子組、突變啟動子組），上游增強子功能分析（陽性對照Ⅰ組、野生增強子組、突變增強子組、反向野生增強子組、反向突變增強子組），下游增強子功能分析（陽性對照Ⅱ組、下游野生增強子組、下游突變增強子組、下游反向野生增強子組、下游反向突變增強子組）。應用SPSS21.0對

5、數據進行處理，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較CYP3A4 mRNA表達的差異，檢驗水準α=0.05。
　　提取 HepG2細胞核蛋白，加入生物素標記 CYP3A4*1G野生型及突變型探針，鏈霉親和素pull-down，聚丙烯酰胺凝膠電泳后硝酸銀染色，HPLC-MS/MS質譜分析CYP3A4*1G結合的蛋白。
　　結果：
　　(1) CYP3A4內含子10啟動子功能分析結果：陽性對照Ⅰ組、野生啟動子組、突變啟動子

6、組均能夠有效地啟動CYP3A4基因表達。野生啟動子組與陽性對照Ⅰ組 CYP3A4 mRNA表達水平沒有顯著差異（P>0.05），突變啟動子組 CYP3A4 mRNA表達水平顯著低于陽性對照Ⅰ組（P<0.05）和野生啟動子組（P<0.01）；
　　(2) CYP3A4內含子10上游增強子功能分析結果：無論CYP3A4*1G野生型還是突變型，反向組CYP3A4 mRNA表達水平均高于正向組（P<0.01）；而CYP3A4內含子10無論

7、是正向還是反向，CYP3A4*1G野生型組CYP3A4 mRNA表達水平均高于突變型組（P<0.01）；此外，突變增強子組CYP3A4 mRNA表達水平低于陽性對照Ⅰ組，不但沒有增強CYP3A4啟動子的功能反而有所減弱。
　　(3) CYP3A4內含子10下游增強子功能分析結果：CYP3A4內含子10無論正向、反向、野生、突變均增強了 CYP3A4啟動子的活性，但該增強作用弱且不受CYP3A4*1G調控，盡管正向的增強水平高于反向

8、，但對方向的依賴性并不十分顯著。
　　(4) CYP3A4*1G及其側翼序列結合轉錄因子分析結果：聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染結果顯示突變型標記探針組結合蛋白條帶數明顯多于野生型標記探針組，且顏色深淺有區(qū)別；分別加對應的冷探針后，兩者的特異性蛋白條帶明顯減少，且條帶的顏色深淺差別更明顯；鏈霉親和素 pull-down蛋白溶液 HPLC-MS/MS結果顯示突變型標記探針結合蛋白數目（738個）多于野生型標記探針結合蛋白數目（697個）。<