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文檔簡(jiǎn)介
1、味覺(jué)是動(dòng)物攝食行為的決定性因素,甜味作為味覺(jué)中最神秘的基本味覺(jué)形式,賦予動(dòng)物食物營(yíng)養(yǎng)信息。近幾十年來(lái)甜味受體的發(fā)現(xiàn)及其功能的確定,為人類食品的開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)及人類健康提供了大量理論基礎(chǔ)。但甜味識(shí)別機(jī)制的深入探索受到了甜味受體晶體結(jié)構(gòu)缺失的嚴(yán)重限制。所以本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)之上,以帶有人類甜味受體T1R2和T1R3基因的pcDNA3.1重組質(zhì)粒為對(duì)象亞克隆了人類甜味受體基因胞外端,以此為基礎(chǔ)構(gòu)建甜味受體胞外端的真核表達(dá)載體pIRES-T
2、1R2-T1R3,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染外源表達(dá)載體HEK293SGnTI-細(xì)胞,獲得高效表達(dá)的人類甜味受體胞外端蛋白,并對(duì)其進(jìn)行純化和表達(dá)鑒定,以期在甜味識(shí)別的熱力學(xué)及甜味受體結(jié)構(gòu)等研究中獲得更多信息。
研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
(1)含有甜味受體胞外端基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)NCBI基因庫(kù)中人類甜味受體基因T1R2/T1R3胞外段序列設(shè)計(jì)出特異性引物,以含全長(zhǎng)hT1R2和hT1R3基因的pcDNA
3、TM3.1/Zeo(+)和pcDNATM3.1/Zeo(-)質(zhì)粒為模板,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得了目的基因,將其回收、純化經(jīng)酶切后與克隆載體pIRES連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在含氨芐青霉素的LB平板上篩選出陽(yáng)性克隆質(zhì)粒,挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)培,抽提后凝膠電泳驗(yàn)證其大小為9,000bp左右,與理論大小相一致;基因測(cè)序結(jié)果與NCBI中甜味受體胞外端基因比對(duì)匹配吻合,表明成功的構(gòu)建了pIRES-T1R2-T1R3重組質(zhì)粒。
4、(2)甜味受體蛋白表達(dá)及純化
利用293-FreeTMTransfectionReagent試劑將重組質(zhì)粒pIRES-T1R2-T1R3轉(zhuǎn)染到覆蓋率為60%~70%的HEK293SGnTI-細(xì)胞,收集轉(zhuǎn)染48h后的HEK293SGnTI-細(xì)胞,提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),目的蛋白成功表達(dá),其條帶大小為50kDa左右;Ni柱樹(shù)脂對(duì)粗蛋白進(jìn)行純化,蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)顯示目的蛋白條帶單一,表明純化成功,測(cè)得其濃度為0.845
5、mg/mL。
(3)表達(dá)結(jié)果的鑒定
分別采用免疫組織化學(xué)、等溫量熱滴定(ITC)、質(zhì)譜和N-端測(cè)序的方法,對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。細(xì)胞免疫結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染細(xì)胞與陽(yáng)性對(duì)照組表達(dá)有甜味受體蛋白的人結(jié)腸癌細(xì)胞NCI-H716免疫效果一致,細(xì)胞膜上呈綠色熒光,表明重組質(zhì)粒pIRES-T1R2-T1R3成功在HEK293SGnTI-細(xì)胞中表達(dá),功能與天然的甜味受體幾乎一致;與甜味劑葡萄糖的ITC滴定結(jié)果顯示,試驗(yàn)組重組蛋白與
6、對(duì)照組NCI-H716細(xì)胞一樣都是放熱的過(guò)程,但重組蛋白與葡萄糖的滴定曲線趨勢(shì)變化顯著,避免了眾多因素的影響逐漸達(dá)到平衡,表明目的蛋白可以取代細(xì)胞作為甜味識(shí)別熱力學(xué)研究的受體原料;N-端測(cè)序結(jié)果顯示無(wú)氨基酸峰出現(xiàn),表明目的蛋白N端封閉,所以無(wú)法利用Edman降解獲得N-端氨基酸序列的信息;重組蛋白質(zhì)譜結(jié)果顯示:其分子量大小為50,529Da,與SDS-PAGE檢測(cè)的50kDa結(jié)果一致;重組蛋白等電點(diǎn)為5.52,序列覆蓋率為12%,通過(guò)蛋
7、白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到與其匹配的肽段分別是:SNMNMFESYINNLR,LEGLTDEINFLRQLYEEEIR,ASLEAIADAEQR和LALDIEIATYR,匹配的蛋白為人源甜味受體T1R2/T1T3,說(shuō)明成功表達(dá)純化出目的蛋白。
總之,本文在前期研究的基礎(chǔ)上,采用多種實(shí)驗(yàn)手段,成功的構(gòu)建了含甜味受體胞外端的真核表達(dá)載體,脂質(zhì)體介導(dǎo)其在HEK293SGnTI-細(xì)胞中表達(dá),Ni柱樹(shù)脂純化,并進(jìn)一步通過(guò)免疫組化、ITC、質(zhì)譜
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