豬繁殖與呼吸綜合征病毒誘導(dǎo)bystander細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為主要特征的傳染病。細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物嚴(yán)格調(diào)控的一種生理過程，病毒感染等多種外界刺激也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究表明PRRSV不僅可誘導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡，也可誘導(dǎo)未感染的bystander細(xì)胞發(fā)生凋亡。PRRSV誘導(dǎo)感染細(xì)

2、胞凋亡的分子機(jī)制已有報(bào)道，但是，PRRSV如何誘導(dǎo)未感染的bystander細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制還不清楚。為了解析PRRSV誘導(dǎo)未感染的bystander細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制，開展了如下研究。
　　本研究首先通過分泌蛋白組學(xué)技術(shù)分析了PRRSV感染porcine alveolar macrophage(PAM)細(xì)胞的培養(yǎng)上清組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRSV感染PAM細(xì)胞后可引起分泌蛋白表達(dá)譜的改變。通過分析這些分泌蛋白變化，發(fā)現(xiàn)非經(jīng)典分泌途徑

3、是PRRSV感染后重要的分泌途徑。PRRSV感染后，IRF3、TNF和CCL4等參與Toll樣受體信號通路的蛋白，以及PPP3CB和STMN等參與MAPK信號通路的蛋白表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，提示PRRSV感染可改變宿主細(xì)胞間的信號傳遞。
　　本研究分析了PRRSV接種的培養(yǎng)細(xì)胞中，未感染的bystander PAM細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRSV可誘導(dǎo)未感染的bystander PAM細(xì)胞發(fā)生凋亡。收獲PRRSV感染早期PAM細(xì)胞的培養(yǎng)

4、上清，孵育新培養(yǎng)的PAM細(xì)胞可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，表明細(xì)胞上清中含有引起細(xì)胞凋亡的物質(zhì)。結(jié)合PRRSV感染細(xì)胞分泌蛋白組學(xué)結(jié)果，推測TNF-α是引起bystander PAM細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要成分。PRRSV培養(yǎng)上清中加入TNF-α特異性抗體中和TNF-α后，顯著抑制了培養(yǎng)上清誘導(dǎo)PAM細(xì)胞凋亡的發(fā)生，證實(shí)了培養(yǎng)上清中的TNF-a是誘導(dǎo)bystander細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要成分。此外，本研究還通過IFA實(shí)驗(yàn)證明了細(xì)胞上清中的TNF-α主要由P

5、RRSV感染細(xì)胞分泌，闡明了PRRSV通過誘導(dǎo)感染的PAM細(xì)胞分泌TNF-α進(jìn)而誘導(dǎo)未感染的bystander PAM細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制。
　　本研究發(fā)現(xiàn)PRRSV感染早期可誘導(dǎo)未感染的bystander PAM細(xì)胞發(fā)生凋亡，但PRRSV感染PAM細(xì)胞很少發(fā)生凋亡。在PRRSV感染早期，細(xì)胞培養(yǎng)中添加外源性TNF-α，PRRSV感染PAM細(xì)胞凋亡率與未添加組相比無顯著差異。通過IFA、Western blot和流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，

6、與未感染的bystander PAM細(xì)胞相比，PRRSV感染PAM細(xì)胞的TNF-α受體TNFR1的表達(dá)顯著下降，解析了PRRSV感染早期感染細(xì)胞阻礙TNF-α誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP3可下調(diào)TNFR1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，從而認(rèn)為GP3可能是阻礙PRRSV感染PAM細(xì)胞對TNF-α的敏感性和細(xì)胞凋亡的病毒蛋白。
　　綜上所述，PRRSV誘導(dǎo)感染PAM細(xì)胞分泌TNF-α，從而引起未感染的bystander P