TGF-β1緩釋微球殼聚糖支架對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的研究.pdf

1、第1章不同脫乙酰度殼聚糖支架制備及降解性能評(píng)價(jià)
　　 目的:制備不同脫乙酰度殼聚糖三維支架并考察其體內(nèi)、外降解性能,為殼聚糖作為軟骨缺損修復(fù)支架材提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:用脫乙酰度分別為65％、80％、95％殼聚糖,以相分離法制備三維支架,SEM觀察其表面形態(tài)、孔徑,以液體替代法檢測(cè)孔隙率,吸水溶脹率；含溶菌酶107 U/L的PBS溶液(pH7.4)37℃氣浴振蕩,測(cè)不同時(shí)間(1 d,3 d,7 d,14d,21

2、 d,28 d)支架降解率,植入SD大鼠豎棘肌內(nèi),分別檢測(cè)2周、4周、6周、8周、10周、12周降解率及觀察其降解支架與組織局部情況。
　　 結(jié)果:不同脫乙酰度支架均具高孔隙三維結(jié)構(gòu),隨脫乙酰度增加孔隙率分別為93.6％、90.0％、85.1％,支架顏色由淡黃漸變白,溶脹率分別為820％、803％、772％,在體外溶菌酶的作用下逐步降解,至第28d時(shí)不同脫乙酰度支架分別降解為30.44％、22.88％、17.10％,且逐步降解第

3、4周時(shí)降解率為57.48％,40.23％,29.53％。HE檢測(cè)示與周圍肌組織具有良好的相容性
　　 結(jié)論:支架具有良好的三維孔隙結(jié)構(gòu),能在體內(nèi)外逐步降解,脫乙酰度越高降解越慢,相同時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)降解速率快于體外降解,脫乙酰度為80％的殼聚糖降解速率與正常軟骨8周修復(fù)相一致。
　　 第2章緩釋TGF—β1殼聚糖微球的制備及性能檢測(cè)
　　 目的:運(yùn)用乳化交聯(lián)法制備殼聚糖微球,以包裹轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)并檢

4、測(cè)其溶脹率、載藥量及緩釋等性能,評(píng)估利用殼聚糖微球作為控釋TGF—β1載體的可行性。
　　 方法:以液體石蠟為乳化劑,三聚磷酸鈉(TPP)為交聯(lián)劑,采用乳化交聯(lián)法制備殼聚糖微球。以包裹TGF—β1及牛血清白蛋白(BSA),分別制備TGF—β1殼聚糖微球與BSA殼聚糖微球。應(yīng)用掃描電鏡、激光顆粒分布測(cè)量?jī)x檢測(cè)微球形態(tài),檢測(cè)球溶脹率,ELISA夾心法測(cè)定微球載藥量、包封率及體外藥物緩釋率等綜合分析微球特性。
　　 結(jié)果:制備

5、的微球粒徑分布集中,平均粒徑35μm,球形良好,球體均勻表面光滑,在酸環(huán)境下溶脹率最高,達(dá)800％；具有較高的包封效率88％,載藥量為11ng/mg,藥物釋放試驗(yàn)表明TGF—β1及BSA均可以從微球中緩慢釋放,第7天累積釋藥量達(dá)90％,63.3％；在溶菌酶降解作用下逐步降解,6周時(shí)降解為57％。
　　 結(jié)論:乳化交聯(lián)法制備殼聚糖緩釋微球方法簡(jiǎn)單易行,所得TGF—β1殼聚糖微球具有良好的緩釋性能,其作為軟骨組織工程材料具有潛在的應(yīng)

6、用價(jià)值。
　　 第3章負(fù)載可降解緩釋微球殼聚糖支架生物相容性實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:制備負(fù)載緩釋微球殼聚糖支架并對(duì)其生物相容性進(jìn)行體內(nèi)外評(píng)價(jià),為殼聚糖作為一類有前途的動(dòng)物軟骨缺損修復(fù)支架材料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:以乳化交聯(lián)法及相分離法制備負(fù)載緩釋微球多孔殼聚糖支架材料。以溶血試驗(yàn)、急性毒性實(shí)驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)、熱源性實(shí)驗(yàn)、肌內(nèi)植入實(shí)驗(yàn),整體評(píng)價(jià)自制負(fù)載緩釋微球殼聚糖支架的生物相容性。
　　 結(jié)果:材料孔

7、徑多為200—350μm且相互貫通的三維立體多孔結(jié)構(gòu),各孔以板狀分開,孔隙率為93.63％±0.51％(n=6,(X)±S)；支架溶血率為1.6％,鏡下未見明顯紅細(xì)胞破壞；材料急性毒性評(píng)價(jià)程度為無毒,材料浸提液組小鼠24h,48h,72h體重變化分別為0.3467±0.1075,0.4020±0.0796,0.4932±0.0838,各時(shí)間點(diǎn)與生理鹽水組組間配對(duì)t檢驗(yàn)P>0.05；皮內(nèi)原發(fā)刺激記分及原發(fā)刺激指數(shù)(PⅡ)均為0；熱源性實(shí)驗(yàn)

8、體溫升高度為0.17±0.06；肌內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)大鼠均成活,全身良好、無感染,4周左右新生毛正常分布,8周大體觀察支架周圍血管明顯增多,與周圍肌組織整合良好,心肝肺腎等內(nèi)臟均無特殊,1周、2周、4周、8周、12周隨時(shí)間延長(zhǎng),淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減少,可見血管及纖維長(zhǎng)入支架,包裹逐漸變薄,支架漸降解。
　　 結(jié)論:負(fù)載微球多孔殼聚糖支架具有優(yōu)良的生物相容性,具有良好的三維孔隙結(jié)構(gòu)及可降解性,有望成為一種良好的軟骨修復(fù)材料。
　　

9、第4章制備負(fù)載TGF—β1微球殼聚糖支架并考察其對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)
　　 目的:研制負(fù)載緩釋TGF—β1微球殼聚糖支架,探討其體內(nèi)吸附自身髓腔中骨髓細(xì)胞及微環(huán)境中信號(hào)因子,誘導(dǎo)軟骨缺損處原位成軟骨細(xì)胞再生分化的效應(yīng)性。
　　 方法:乳化交聯(lián)法制備具有緩釋TGF—β1功能的殼聚糖微球,與液相分離法制得殼聚糖支架共混得復(fù)合支架,采用環(huán)境掃描電鏡(SEM)觀察支架及微球形態(tài),激光顆粒分布測(cè)量?jī)x檢測(cè)微球直徑分布,ELISA夾心

10、法測(cè)微球TGF—β1包封率,載藥量以及緩釋率,體外檢測(cè)微球及支架4周降解率；選用兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成雙側(cè)股骨滑車部全層軟骨缺損,采用不同的材料[TGF—β1微球/殼聚糖支架(MS-TGFs)、TGF—β1/殼聚糖支架(CS-TFG)、單純殼聚糖支架(CS)植入缺損處進(jìn)行原位缺損修復(fù),設(shè)空白組對(duì)照(empty)]構(gòu)成四組,觀察修復(fù)效果。于術(shù)后1月、3月取材,大體觀察軟骨修復(fù)狀況并予Masuoka評(píng)分,固定組織行甲苯胺藍(lán)染色,Ⅱ型膠原免疫組織

11、化學(xué)及Wakitani評(píng)分綜合評(píng)估組織修復(fù)質(zhì)量。
　　 結(jié)果:四組植入物的兔膝關(guān)節(jié)均無關(guān)節(jié)腔感染、積液,Masuoka評(píng)分MS-TGFs,CS-TGF,CS,Empty組依次為7.67±0.47；3.83±0.75；1.00±0.89；0.83±0.75。組織1、3月取材TB染色示MS-TGFs修復(fù)最佳,填充面光滑平整,關(guān)節(jié)軟骨排列整齊,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,連續(xù)；CS-TGF修復(fù)欠佳,表面平整性差,軟骨量少；CS為大量纖維軟骨組織填充

12、；Empty組無修復(fù),且周圍軟骨繼發(fā)損壞,缺損直徑約為5mm；第1月CD34、CD44雙組化鑒定吸附細(xì)胞為干細(xì)胞的來源。MS-TGVs組CD34(-)CD44(+)細(xì)胞最多,其次為CS—TGF組。第3月甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫組化染色可見明顯軟骨細(xì)胞及膠原異染,組織修復(fù)質(zhì)量Wakitani評(píng)分示:4.50±1.12；10.83±0.37；13.67±0.47,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　 結(jié)論:殼聚糖復(fù)合支架在一定程度