鈉泵α1亞基M3-M4膜外區(qū)特異性結(jié)合肽的篩選及生物學(xué)活性研究.pdf

1、鈉泵(Na+/K+-ATPase)是哺乳類(lèi)生物細(xì)胞膜上普遍存在的一種介導(dǎo)離子轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜載體蛋白，它由α、β、γ三個(gè)亞單位組成，其中α亞基具有酶的活性。α亞基有α1、α2、α3、α4四種亞型，各個(gè)亞型的基本結(jié)構(gòu)高度保守，都有10個(gè)跨膜區(qū)即M1-M10。其膜外區(qū)序列含有多種鈉泵調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點(diǎn)，包括內(nèi)源性鈉泵抑制劑--哇巴因的結(jié)合位點(diǎn)。目前認(rèn)為，α亞基的第二個(gè)跨膜區(qū)M3-M4是哇巴因的一個(gè)重要結(jié)合位點(diǎn)。哇巴因與鈉泵結(jié)合后，抑制鈉泵活性，進(jìn)

2、而促使血壓升高。因此，本研究將從噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中篩選鈉泵α1亞基M3-M4膜外區(qū)特異性結(jié)合肽，通過(guò)此結(jié)合肽來(lái)封閉哇巴因M3-M4結(jié)合位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)抑制哇巴因與鈉泵的結(jié)合，并通過(guò)檢測(cè)此鈉泵結(jié)合肽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和SHR大鼠血壓的作用，進(jìn)一步探討鈉泵與其抑制因子的可能作用機(jī)制，為高血壓的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　一、鈉泵α1亞基M3-M4膜外區(qū)結(jié)合肽的篩選
　　目的：以鈉泵α1亞基M3-M4膜外區(qū)蛋白為靶標(biāo)，從噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)中篩選

3、出能與之特異性結(jié)合的多肽，以拮抗哇巴因?qū)︹c泵的抑制作用，并檢測(cè)此特異性結(jié)合短肽與哇巴因是否競(jìng)爭(zhēng)抑制關(guān)系。
　　方法：(1)以鈉泵α1亞基M3-M4膜外區(qū)序列(ILEYTWLEAGGGS)為靶蛋白，利用噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)技術(shù)，通過(guò)3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的淘選，使與靶蛋白特異性結(jié)合的噬菌體得到大量富集。(2)雙夾心ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定噬菌體陽(yáng)性克?。阂遭c泵α1亞基M3-M4膜外區(qū)序列(ILEYTWLEAGGGS)包被ELISA板，同時(shí)

4、設(shè)陰性對(duì)照，加入隨機(jī)挑選的30個(gè)噬菌體原種上清，加HRP-抗M-13抗體，顯色后于420 nm測(cè)定OD值。(3)濃度依賴性實(shí)驗(yàn)：以鈉泵α1亞基M3-M4膜外區(qū)序列(ILEYTWLEAGGGS)為靶蛋白，每個(gè)待鑒定克隆包被8個(gè)孔，將噬菌體克隆擴(kuò)增后測(cè)定滴度，加入～1012pfu的噬菌體并進(jìn)行5倍系列稀釋，加入HRP-抗 M-13抗體，顯色后測(cè)定OD值，以稀釋倍數(shù)對(duì)吸光度作圖。(4)噬菌體ssDNA的提取及序列分析：采用M13噬菌體ssDN

5、A快速提取試劑盒提取噬菌體ssDNA，測(cè)序后，根據(jù)“隨機(jī)十二肽-gⅢ融合蛋白的N末端序列”，確定插入片段的基因序列，參照“遺傳密碼表”翻譯出篩選多肽序列。(5)畦巴因競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)：將待鑒定的噬菌體上清進(jìn)行2倍系列稀釋，各取50μL與50μL100μg/mL哇巴因混勻，放入已包被靶蛋白的酶聯(lián)板中，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，加入HRP-抗M-13抗體，顯色后測(cè)定OD值，以稀釋倍數(shù)對(duì)吸光度作圖。
　　結(jié)果：(1)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)篩選結(jié)果：3輪

6、生物篩選中，陽(yáng)性噬菌體的產(chǎn)出與投入比率逐輪提高，表明篩選出的噬菌體得到了選擇性的富集。(2)雙夾心ELISA實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)挑選的30個(gè)噬菌體克隆中21個(gè)樣品孔與陰性對(duì)照孔OD比值≥2.1，確定為陽(yáng)性克隆。(3)濃度依賴性實(shí)驗(yàn)：從稀釋倍數(shù)對(duì)吸光度的圖中看出，21個(gè)陽(yáng)性克隆均具有濃度依賴性，提示有較好的親和力。(4)噬菌體ssDNA的提取及序列分析：提取21個(gè)噬菌體克隆的ssDNA，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，目的條帶7500 bp左右與

7、噬菌體DNA大小相符。測(cè)序結(jié)果表明，21個(gè)陽(yáng)性噬菌體包含3種結(jié)合短肽，分別為肽A：SWYQEGPSTQPE一致率達(dá)47.6％(10/21)。肽B：SSNTAWQNMTSL一致率為28.6％(6/21)。肽C：GENPWENVAVAM一致率為23.8％(5/21)，合成肽A作為鈉泵結(jié)合肽。(5)哇巴因競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)：結(jié)果表明，相同濃度的噬菌體上清，在哇巴因存在的情況下，其OD值比陰性對(duì)照降低；隨著噬菌體上清中結(jié)合肽濃度的降低，其對(duì)哇巴因與

8、靶蛋白結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)力亦逐漸降低，說(shuō)明結(jié)合肽與哇巴因是競(jìng)爭(zhēng)抑制關(guān)系，篩選到的結(jié)合肽能夠特異性地與鈉泵α1亞基M3-M4膜外區(qū)的表位識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合。
　　結(jié)論：以鈉泵α1亞基M3-M4膜外區(qū)序列(ILEYTWLEAGGGS)為靶蛋白，從噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)中成功獲得了能夠與之特異性結(jié)合的多肽(SWYQEGPSTQPE)。為進(jìn)一步探討鈉泵與哇巴因的作用機(jī)制及高血壓的治療奠定了基礎(chǔ)。
　　二、鈉泵結(jié)合肽的生物學(xué)活性分析
　　目的：檢

9、測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)哇巴因刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖或凋亡的影響，并檢測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血壓的影響，探討該鈉泵結(jié)合肽在高血壓病治療中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：(1)MTT法檢測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)生理濃度的哇巴因刺激EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響：取96孔板各組細(xì)胞，分別加入生理濃度(0.3×10-9，0.6×10-9，0.9×10-9 mol/L)的哇巴因及10-6mol/L的鈉泵結(jié)合肽，以不加鈉泵結(jié)合肽組為陰性對(duì)照。培

10、養(yǎng)24、48、72 h后，加20μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，加入DMSO，于酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度值。(2)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)高濃度哇巴因刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響：取完全貼壁的各瓶細(xì)胞，分別加入高濃度(10-4，10-6 mol/L)的哇巴因及10-4mol/L的鈉泵結(jié)合肽，以不加鈉泵結(jié)合肽組為陰性對(duì)照。培養(yǎng)24 h后，離心收集細(xì)胞，70％的冷乙醇固定，4℃冰箱存放。加入碘化丙啶(PI)染色30 min后

11、，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率。(3)鈉泵結(jié)合肽對(duì)SHR大鼠血壓的影響：給藥組SHR大鼠尾靜脈注射2 mg/kg鈉泵結(jié)合肽，于給藥后15 min，30 min，45 min，60 min分別測(cè)量大鼠的血壓值并記錄，以注射生理鹽水組為陰性對(duì)照。
　　結(jié)果：(1)MTT法檢測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)生理濃度的哇巴因刺激EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響：哇巴因濃度為0.6×10-9mol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞有最大增殖作用(P＜0.05)，且在此基

12、礎(chǔ)上，加上鈉泵結(jié)合肽后，細(xì)胞的增殖率較哇巴因單獨(dú)存在時(shí)有所降低，24 h、48 h、72 h分別降低10.24％、18.35％、16.18％。(2)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)高濃度哇巴因刺激EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響：結(jié)果顯示，高濃度哇巴因(10-4mol/L、10-6mol/L)均可刺激EA.hy926細(xì)胞發(fā)生凋亡，且具有顯著性差異(P＜0.01)，當(dāng)加入10-4mol/L鈉泵結(jié)合肽時(shí)，10-6mol/L哇巴因組的細(xì)胞凋亡率

13、顯著下降(P＜0.01)。(3)SHR大鼠尾靜脈注射2 mg/kg鈉泵結(jié)合肽后，其血壓開(kāi)始逐漸下降，到第15 min血壓出現(xiàn)最低值，由原來(lái)水平203.2±5.28 mmHg降至179.8±4.83 mmHg，較原水平降低11.5％，隨后逐漸上升，到60 min左右血壓基本恢復(fù)到給藥前水平。
　　結(jié)論：篩選到的鈉泵結(jié)合肽能夠拮抗哇巴因?qū)︹c泵的結(jié)合，影響哇巴因誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖或凋亡，并且能夠引起SHR大鼠血壓下降，提示鈉泵結(jié)合肽