促紅細(xì)胞生成素對(duì)心肌梗死后小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響.pdf

1、背景：
　　心肌梗死（Myocardial Infarction，MI）是一類由于心肌長時(shí)間缺血缺氧，最終導(dǎo)致心肌損傷甚至壞死的一類疾病。到2020年，全球心血管病的死亡率將增加50％，其中MI將位于死因榜的首位，MI已給全球醫(yī)療帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。
　　隨著各種醫(yī)療技術(shù)的應(yīng)用，目前MI急性期的死亡率已明顯下降。但是MI后，大量缺血壞死心臟細(xì)胞會(huì)被纖維組織所取代形成瘢痕，直接影響心臟的舒縮功能，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。目前藥物

2、治療、介入治療以及外科冠狀動(dòng)脈旁路搭橋術(shù)也只能恢復(fù)局部心肌血液供應(yīng)，延緩不利的心肌重塑，而不能從根本上解決心肌梗死后心肌數(shù)目減少、心功能進(jìn)行性下降這一根本問題。因此，針對(duì)性防治各類心肌細(xì)胞死亡或促進(jìn)心肌細(xì)胞再生，一直是MI治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。
　　促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)是由腎臟分泌的一類糖蛋白類激素，臨床上已經(jīng)將它廣泛用于貧血的治療，現(xiàn)在已逐步發(fā)現(xiàn)它在心血管系統(tǒng)的獨(dú)特作用：它具有抗凋亡、抗炎、抗氧化

3、、促干細(xì)胞遷移、增殖、分化和促進(jìn)血管生成的作用，因此，我們推測(cè)：EPO在一定程度上可能對(duì)于損傷心肌具有保護(hù)作用。但有研究表明，其全身用藥會(huì)帶來許多副作用，如：發(fā)熱、腹瀉、嘔吐、氣喘和上呼吸道感染，甚至?xí)霈F(xiàn)高血壓、癲癇和血栓等。因此，如何選擇EPO的給藥方式至關(guān)重要。
　　綜上所述，為深入觀察 EPO對(duì)梗死后心臟的治療作用，我們建立了小鼠心肌梗死模型，并于術(shù)后3天給予EPO心肌注射治療，隨后動(dòng)態(tài)檢測(cè)了術(shù)后1周、2周、4周的心臟結(jié)構(gòu)

4、和功能的變化情況及心肌細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。通過以上研究，以期發(fā)現(xiàn)EPO對(duì)MI的療效，為臨床治療MI提供新的思路和方法。
　　目的：
　　(1)建立成年小鼠心肌細(xì)胞分離的有效方法；
　　(2)觀察EPO對(duì)心梗后心臟結(jié)構(gòu)和功能，以及心肌細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)影響。
　　方法：
　　(1)改良成年小鼠心室肌細(xì)胞(Adult Mouse Ventricular Cardiomyoctyes, AVCMS)分離方法。使用

5、本實(shí)驗(yàn)獨(dú)創(chuàng)的手術(shù)方法，給未成年雄性C57小鼠心臟行在體冠脈逆行插管，經(jīng)Langendorff灌流沖洗干凈心臟，膠原酶液充分酶解消化心臟，將其撕碎并吹打成細(xì)胞懸浮液后，置于細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與經(jīng)典離體插管分離方法對(duì)比了插管時(shí)間，細(xì)胞成活率和細(xì)胞收獲量。
　　(2)新式小鼠 AMI模型建造方法。麻醉小鼠后，仰臥位固定，于左胸前壁剪一微型斜切口，鈍性分離肌肉，將心臟擠壓至胸腔外，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左主降支，見心尖處變灰白后，迅速將心臟

6、復(fù)位，擠出胸腔中的氣體，荷包縫合術(shù)閉合肌肉和皮膚。偽手術(shù)組是在冠狀動(dòng)脈下方穿過手術(shù)線而不結(jié)扎。
　　(3)心肌內(nèi)注射EPO或PBS。確定建模成功的小鼠，MI術(shù)后三天，再次打開胸腔，暴露心臟，在心臟缺血區(qū)的邊緣3點(diǎn)注射20 ul EPO或PBS。實(shí)驗(yàn)小鼠分為五組：偽手術(shù)組、sham+EPO組、sham+PBS組、MI+EPO組和MI+PBS組，分別于手術(shù)后7天、14天、28天，用天平稱重法、TTC染色、Masson染色和小動(dòng)物超聲觀

7、察心臟的重量、心梗面積、心肌纖維化程度和心功能的動(dòng)態(tài)變化。
　　(4)觀察 EPO對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。MI手術(shù)后7天取心室肌組織制備石蠟切片，通過TUNEL染色來對(duì)比兩組心肌細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化。
　　結(jié)果：
　　(1)AVCMS的分離：急性分離小鼠心室肌細(xì)胞，呈長桿狀，條紋清晰，快速在體主動(dòng)脈插管基礎(chǔ)上，每只小鼠可以獲得6.1±0.27×106個(gè)AVCMS，且培養(yǎng)24h后細(xì)胞的成活率為58.4±10.92%。

8、　　(2)EPO對(duì)心梗后心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響：MI+EPO組較對(duì)照MI+PBS組，在術(shù)后1、2、4周，小鼠存活率高，心梗面積明顯縮小；心肌纖維化程度較低，且心臟功能均優(yōu)于對(duì)照組。
　　(3)EPO對(duì)心梗心肌細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)影響：在MI術(shù)后1周，通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，EPO能顯著降低細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)論：
　　(1)在體分離成年小鼠心室肌細(xì)胞法較離體法，用時(shí)較短、細(xì)胞收獲量更多、細(xì)胞存活率更高。
　　(2)EP