線粒體靶向多功能近紅外小分子光敏劑的合成與生物學活性研究.pdf

1、目的：
　　腫瘤光學治療是目前臨床上繼外科手術治療、化學治療、放射治療之外的新型治療手段。其治療原理是先給予對腫瘤組織有選擇性的光敏劑，然后使用特定波長的激光輻照腫瘤區(qū)域，從而使光敏劑高效地催化組織中的氧分子轉(zhuǎn)化為對細胞結(jié)構(gòu)、功能有損害的活性氧物質(zhì)，或者使光敏劑吸收光能并轉(zhuǎn)化為局部高熱，最終實現(xiàn)治療腫瘤的目的。相對于腫瘤手術治療、化療、放療等目前臨床上采用的主要治療手段，腫瘤光學治療具有損傷部位小、選擇性高、安全性好等優(yōu)勢，可望在

2、腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。根據(jù)不同的作用原理，腫瘤光學治療主要分為光動力學治療(PDT)和光熱治療(PTT)。無論是PDT或者PTT治療，決定它們療效的關鍵在于制備理想的光敏劑。理想的光敏劑至少應同時具有兩種特性:高效的光敏特性和良好的腫瘤選擇性。(1)為了提高光敏特性:一方面，許多研究者分別將具有光熱作用的光敏劑與光動力作用的光敏劑組裝或偶聯(lián)在一起，制備出了多種同時具有PDT和PTT治療效應的納米材料類的光敏劑，大大提高了腫瘤光學治療的

3、療效;另一方面，由于生物組織對近紅外波段(700-900 nm)的光吸收較弱，因此選擇近紅外類的光敏劑可實現(xiàn)更深層組織的光學治療，顯著地推進了光學治療的應用前景。(2)為了增強光敏劑對腫瘤細胞的選擇性，最常采用的策略是通過化學方法將光敏劑與靶向配體進行連接，使光敏劑能夠被腫瘤細胞膜上特異性表達的受體識別并高效地結(jié)合，從而賦予了光敏劑的靶向性。然而，納米材料類的光敏劑將面臨很多難題，比如難以大規(guī)模地制備、易被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織器官截留、潛在毒性

4、等，導致大部分納米材料類的光敏劑還停留在早期開發(fā)階段。同時，基于化學連接策略開發(fā)靶向性光敏劑可能會改變靶向配體的結(jié)構(gòu)與功能、增加額外的合成步驟和成本，這些影響因素同樣會妨礙它們的實際應用。鑒于目前常用光敏劑的以上不足，研發(fā)不依賴于納米高分子材料、也不需要復雜的化學連接，而是基于本身化學結(jié)構(gòu)內(nèi)在的多功能特性的小分子類靶向光敏劑，可望避免上述問題，提高臨床轉(zhuǎn)化應用的潛力，推進和擴大腫瘤光學治療的前景。
　　線粒體是細胞生存的重要細胞器

5、，其在能源制造和細胞凋亡通路中發(fā)揮著核心作用。因此，線粒體一直被認為是抗腫瘤治療的理想靶點。尤其是最近研究表明，線粒體對過量的活性氧物質(zhì)及高熱非常敏感使得靶向腫瘤細胞線粒體的PDT、PTT療效非常顯著。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了一類具有腫瘤靶向性的吲哚七甲川花菁類近紅外熒光小分子。它們表現(xiàn)出不需要化學連接靶向配體，即能夠被多種腫瘤細胞選擇性攝取，同時蓄積于腫瘤細胞的線粒體中。某些花菁類近紅外熒光小分子化合物已經(jīng)被證明具有一定的光敏效應。據(jù)此

6、本研究設想:以前期獲得的線粒體靶向染料分子為基礎，通過化學結(jié)構(gòu)修飾，可望制備合成同時具有靶向腫瘤細胞線粒體和整合PDT和PTT雙模態(tài)光學治療的吲哚七甲川花菁類近紅外熒光小分子光敏劑，顯著提高光學治療的療效。
　　方法與結(jié)果：
　　根據(jù)前期的構(gòu)效關系研究及其它研究報道，親脂性陽離子特性的吲哚七甲川鏈是對這類小分子的腫瘤細胞線粒體靶向特性起到至關重要作用的官能團。同時，文獻報道花菁類小分子的光敏效應與它們的脂水分布系數(shù)（LogP

7、）、極性、摩爾吸光系數(shù)等密切相關。因此，為了制備一種靶向腫瘤細胞線粒體，同時整合了PDT和PTT雙模態(tài)光學治療的小分子類光敏劑，本論文主要從以下三個方面開展研究，且主要結(jié)果如下:
　　一、腫瘤細胞線粒體靶向化學小分子類光敏劑的設計與合成:在前期構(gòu)效關系研究基礎上，以吲哚七甲川鏈為線粒體靶向的母核結(jié)構(gòu)，通過改變吲哚環(huán)上的N-烷基側(cè)鏈的鏈長（碳數(shù)n=1-5）、改變側(cè)鏈末端的官能團（以甲基、甲氧基、羧基、芳香基、羥基、磺酸基、氨基酸等進

8、行取代），合成了27個具有不同LogP、極性以及摩爾吸光系數(shù)的新型吲哚七甲川花菁類近紅外熒光小分子，為獲得同時具有腫瘤細胞線粒體靶向、同步光熱和光動力治療的多功能小分子提供了候選化合物。
　　二、目標光敏劑的篩選及體外多種腫瘤細胞中的光熱和光動力作用研究:從合成的27個代表性吲哚七甲川花菁類近紅外熒光小分子中，通過腫瘤靶向（腫瘤組織與肌肉組織的蓄積差別）、光熱特性（溶液升溫情況）、光動力特性（單態(tài)氧、ROS生成水平），篩選獲得了具

9、有顯著腫瘤靶向特性、光熱和光動力作用的新型多功能小分子化合物7。進一步在A549、H460、MCF-7、4T1等多種腫瘤細胞株上驗證了化合物7的光誘導殺傷作用;通過冰浴處理或加入NAC（自由基清除劑）進行干預，證實化合物7具有光熱、光動力協(xié)同的殺傷效應;通過將化合物7與兩種線粒體探針(mito-tracker、Rho123)進行共染，確證了其線粒體靶向蓄積特性;通過流式細胞分析和western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞線粒體途徑的細

10、胞調(diào)亡可能是化合物7發(fā)揮光療效果的作用機制。
　　三、體內(nèi)多種荷瘤動物模型上驗證目標光敏劑7的光學治療作用:化合物7的靶向光學治療腫瘤的效果依次在多種皮下移植瘤、原位移植瘤動物模型上進行了驗證。通過近紅外熒光成像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在A549、4T1皮下及4T1原位移植瘤模型中均表現(xiàn)出良好的腫瘤選擇性蓄積特性;向腫瘤部位給予(808 nm、0.8 W/cm2)的激光照射作用5分鐘，然后分別通過紅外熱成像儀監(jiān)測腫瘤部位的溫度變化或檢測腫瘤組

11、織中的ROS生成水平，在體內(nèi)模型中進一步證實了化合物7的光熱、光動力協(xié)同治療作用;通過測量腫瘤體積、動物體重變化情況及動物的生存率，結(jié)果證實化合物7顯著地抑制了腫瘤的生長，在監(jiān)測期間動物的生存率為100％并且沒有動物出現(xiàn)腫瘤復發(fā);通過血常規(guī)、肝腎功能生化指標的測量及主要臟器的病理切片觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，化合物7沒有引起明顯的毒副作用。另外，本研究還在基于臨床病人的腫瘤標本建立的PDX動物模型上確證了化合物7的優(yōu)秀的腫瘤光學治

12、療療效，進一步探索了其臨床轉(zhuǎn)化應用的前景。
　　結(jié)論：
　　本研究工作通過合理設計與化學合成，成功篩選獲得了同時具有腫瘤細胞線粒體靶向特性和PDT與PTT協(xié)同治療作用的多功能近紅外小分子化合物7。這種具有近紅外熒光成像功能的靶向光敏劑還能夠進行腫瘤及腫瘤邊界光學顯像，為實現(xiàn)成像引導的精確光學治療提供了潛在的可能性。這是第一個以腫瘤細胞線粒體為治療靶點，同步實現(xiàn)腫瘤PDT和PTT協(xié)同治療的小分子光敏劑。該光敏劑具有良好的光敏特