木質(zhì)素β-O-4鍵酶解及酶與木質(zhì)素吸附作用的研究.pdf

1、木質(zhì)素是由三種單體通過C-C鍵與C-O鍵連接聚合而成，是一種含量豐富、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然支鏈型芳香族聚合物，其被視為許多高價值的芳香族化合物的潛在替代品。由于木質(zhì)素中的β-醚鍵數(shù)量最為豐富，所以通過Sphingobium sp.strain SYK-6中以NAD+為輔酶的Cα-脫氫酶(LigD)、以谷胱甘肽為輔酶的β-醚酶(LigF)與谷胱甘肽裂合酶(LigG)斷裂β-O-4鍵成為木質(zhì)素降解中的研究熱點。本研究中同時利用還原酶AVR對Lig

2、DFG酶解體系中的較為昂貴的輔酶NAD+與GSH進(jìn)行循環(huán)再利用。本研究中我們利用酶解體系LigDFG+AVR嘗試降解天然木質(zhì)素樣品，并且對木質(zhì)素降解酶LigD、LigF與木質(zhì)素之間的吸附機(jī)制進(jìn)行研究。
　　1、本研究中將基因ligD、ligF、ligG、AVR克隆至大腸桿菌并重組表達(dá)純化，通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件(16℃，IPTG終濃度0.5mmol·L-1，誘導(dǎo)12h)得到可溶性表達(dá)的LigD、LigF、LigG、AVR四種酶，純度都達(dá)

3、到95％以上。利用模型化合物GGE通過高效液相色譜(HPLC)與薄層層析驗證了它們具有較高的體外活性。
　　2、利用酶解體系嘗試降解利用膜分離、有氧氧化的手段得到重均分子量分別為24482Da、1627Da、859Da、725Da、679Da等的木質(zhì)素磺酸鹽樣品及β-O-4鍵Cα位羥基被氧化的木質(zhì)素樣品，利用凝膠滲透色譜(GPC)、高效液相色譜(HPLC)及電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)等分析手段證明該酶解體系對天然木質(zhì)素有一定的降解

4、趨勢，但是酶解效率很低。建立了針對LigF酶解活性的快速檢測方法——比色法與熒光測定法，并進(jìn)行了綜合比對。熒光定量法精確度高出至少1000倍，而比色法操作簡便。
　　3、通過表面等離子體共振(SPR)、等溫滴定量熱法(ITC)、高效液相色譜(HPLC)對木質(zhì)素降解酶LigD、LigF與木質(zhì)素磺酸鹽之間的吸附機(jī)制進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素能夠抑制LigF的活性(MPHPV轉(zhuǎn)化率由99.5％下降至32.6％)，對LigD影響較小(GGE