人EBLN1基因系統(tǒng)進(jìn)化分析及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、背景：人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(human endogenous retroviruses，HERV)是在病毒感染過(guò)程中，其DNA整合到人類基因組并經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期遺傳而產(chǎn)生的。人類基因組中約8%的基因來(lái)自于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。HERV參與胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等多種人體正常生理功能。在分子水平上，HERV可通過(guò)多種方式參與基因表達(dá)調(diào)節(jié)，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或沉默子、多聚腺苷酸化信號(hào)、各種核蛋白結(jié)合位點(diǎn)。研究表明，HERV的異常表達(dá)與人類某些疾病的發(fā)生密切相關(guān)

2、，主要包括神經(jīng)精神疾病、癌癥和免疫性疾病。如HERV-W1在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)和異常活化。因而，深入研究 HERV的生物學(xué)功能有利于揭示人類疾病的致病機(jī)制，HERV有望成為治療的新靶點(diǎn)。
　　EBLN(endogenous borna-like N elements)與博爾納病病毒(borna disease virus,BDV)核蛋白(P40)具有高度同源性的內(nèi)源性非逆轉(zhuǎn)錄病毒。迄今為止，在人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7個(gè)EBLNs

3、，分別命名為EBLN1～EBLN7。其中，EBLN1與BDV N蛋白氨基酸序列的同源性最高。目前人們對(duì)EBLN1的生物學(xué)功能了解甚少。
　　已證實(shí)，EBLN1不僅高表達(dá)于293T、MOLT4細(xì)胞，而且在少突膠質(zhì)(oligodendroglia,OL)細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞(SY5Y)、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87)等神經(jīng)腫瘤細(xì)胞中也呈高表達(dá)。提示EBLN1可能在維持神經(jīng)腫瘤的惡性表型中具有重要作用。
　　BDV是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，包

4、含6個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)，至少表達(dá)6個(gè)病毒蛋白(N、P、X、L、G和M)，其中蛋白N(P40)和P(P23)是BDV致病的關(guān)鍵因子。BDV具有高度嗜神經(jīng)性，主要侵犯邊緣系統(tǒng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，BDV感染可引起宿主行為異常、情緒異常和學(xué)習(xí)記憶障礙。流行病學(xué)調(diào)查表明，BDV感染率在精神分裂癥、雙相情感障礙等神經(jīng)精神疾病的患者明顯高于正常對(duì)照組。BDV可能是人類神經(jīng)精神疾病的致病之一。由此推測(cè)，EBLN1的

5、生物學(xué)功能可能也與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。
　　目的：
　　1、在完成對(duì)5個(gè)BDV病毒株(Hu-H2、HUSA1、Dessau、Cresalo和WR3)全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，分析EBLN1與人源性BDV N基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。
　　2、觀察RNAi技術(shù)抑制EBLN1后OL細(xì)胞、SY5Y細(xì)胞、U87細(xì)胞生物特性的變化，以探討EBLN1在神經(jīng)腫瘤中的作用。
　　3、觀察EBLN1蛋白表達(dá)對(duì)海馬神經(jīng)元的影響及對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的

6、影響，以探討EBLN1蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中的生物學(xué)功能。
　　方法：
　　1、采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增5個(gè)BDV病毒株的全基因組序列；用DNAMAN軟件將5個(gè)病毒株全序列與從GenBank中獲取的BDV全長(zhǎng)序列進(jìn)行同源性比較；用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。同時(shí)進(jìn)行EBLN1與人源性BDV N基因進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析。
　　2、構(gòu)建EBLN1干擾慢病毒載體，感染OL細(xì)胞、SY5Y細(xì)胞、U87細(xì)胞，分別進(jìn)行細(xì)胞增殖，凋

7、亡、細(xì)胞周期、體外克隆、劃痕和Transwell等實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)EBLN1干擾對(duì)神經(jīng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。qRT-PCR檢測(cè)EBLN1干擾對(duì)OL細(xì)胞基因表達(dá)的影響。Western blotting檢測(cè)周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。
　　3、構(gòu)建EBLN1表達(dá)的慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體，分別感染海馬神經(jīng)元和大鼠海馬定位注射。免疫熒光檢測(cè)EBLN1蛋白的細(xì)胞定位。基因芯片檢測(cè)EBLN1蛋白對(duì)神經(jīng)元基因表達(dá)的影響。Western bl

8、otting檢測(cè)突觸可塑料性相關(guān)蛋白的水平。水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　結(jié)果：
　　1、來(lái)自不同宿主的5個(gè)BDV病毒株(Hu-H2、HUSA1、Dessau、Cressalo和 WR3)的全基因組擴(kuò)增和測(cè)序。進(jìn)一步分析得出，人源性BDV病毒株與非人源性病毒株之間的同源性為98.07～99.97%；人源性BDV病毒株在親緣關(guān)系上具有地域特征。此外，EBLN1與人源性BDV N基因的同源性為47.6%～50.82%，

9、并且與來(lái)自德國(guó)病人BDV N基因具有緊密的親緣關(guān)系。
　　2、EBLN1干擾能夠?qū)е翺L、SY5Y和U87細(xì)胞生物特性的改變，分別表現(xiàn)為：OL細(xì)胞增殖受抑、凋亡增加，體外克隆形成減少；SY5Y細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷徙能力減低；U87細(xì)胞增殖受抑、凋亡增加、體克隆形成減少，同時(shí)運(yùn)動(dòng)遷徙能力減低。EBLN1干擾OL細(xì)胞后，3個(gè)與膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖和凋亡密切相關(guān)的基因RND3、OSMR和CREB3L2呈高表達(dá)。EBLN1干擾OL細(xì)胞后，凋亡抑制蛋白B

10、cl-2的表達(dá)明顯減低。而B(niǎo)ax、caspase3和P53的表達(dá)在EBLN1干擾前后無(wú)明顯差異。
　　3、EBLN1蛋白定位于胞漿。EBLN1蛋白在神經(jīng)元表達(dá)后，檢測(cè)到有顯著表達(dá)差異的基因170個(gè)，上調(diào)基因10個(gè)，如NEFM、CCDC148、GPR85等；下調(diào)基因160個(gè)，包括DES、ABCD5、GOLGA6C、ANXA2、PARP4等。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因的功能主要集中在細(xì)胞周期、RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體的固縮和分離等。KE

11、GG分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要與核糖體信號(hào)通路有關(guān)。同時(shí)，EBLN1蛋白可導(dǎo)致神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白PSD95和pERK的表達(dá)水平增加。然而，水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EBLN1蛋白表達(dá)前后，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1、人源性BDV病毒株與非人源性BDV病毒株之間具有很高的同源性。BDV病毒在親緣關(guān)系上具有地域性。EBLN1與人源性BDV病毒株具有緊密的親緣關(guān)系。
　　2、EBLN1干擾能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)腫瘤細(xì)胞的惡性表型