MiR-486調(diào)控造血系統(tǒng)低氧反應的作用與機制.pdf

1、低氧可以影響細胞生長因子的分泌及分化等生物學特性。造血系統(tǒng)是人類對低氧環(huán)境適應的最敏感的組織之一，也是研究細胞低氧反應的理想模型。微小 RNA（microRNA，miRNAs）可以通過調(diào)控功能基因的表達而在細胞的低氧反應中發(fā)揮重要作用。其中，微小 RNA-486（microRNA-486，miR-486）是首先從人的胎肝組織中鑒定發(fā)現(xiàn)的miRNAs，其被證實與造血細胞紅系分化密切相關。而眾所周知低氧環(huán)境可以促進骨髓紅細胞的生成過程，因此

2、，我們推測miR-486可能參與了低氧環(huán)境下骨髓造血的過程。人類對于低氧環(huán)境的適應包括造血干細胞的適應以及造血微環(huán)境的適應。目前，miR-486在骨髓低氧適應中的作用尚不明確，本研究論文以造血微環(huán)境中的重要細胞—骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)及造血細胞系TF-1細胞作為研究對象，旨在研究miR-486在骨髓低氧適應中的作用及機制。本研究分為兩個部分：
　　

3、第一部分：MiR-486調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞低氧反應的作用及機制。
　　目的：探索miR-486在調(diào)控骨髓造血微環(huán)境的重要細胞BM-MSCs低氧反應中的作用，并研究其對 BM-MSCs血管生成因子分泌及細胞存活中的作用及機制。
　　方法：⑴用Ficoll法分離健康成年人骨髓中的單個核細胞，通過貼壁生長獲得BM-MSCs；⑵用qRT-PCR檢測不同培養(yǎng)條件下BM-MSCsmiR-486的表達；⑶用qRT-PCR和ELISA檢測

4、不同培養(yǎng)條件下BM-MSCs細胞因子的表達與分泌；⑷用慢病毒感染技術將 BM-MSCs miR-486過表達或沉默；⑸細胞的生物學特性，包括增殖、凋亡及遷移，均應用了商業(yè)試劑按照說明書檢測；
　　結果：研究顯示我們成功分離、培養(yǎng)、擴增了BM-MSCs；低氧可以促進 BM-MSCs miR-486的表達；與感染對照病毒的BM-MSCs相比，過表達 miR-486可以促進 BM-MSCs細胞因子的分泌及細胞增殖，抑制細胞凋亡；而沉默

5、miR-486可以抑制 BM-MSCs細胞因子分泌，促進細胞凋亡；MiR-486通過調(diào)控 PTEN-PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié) BM-MSCs的生物學特性。
　　結論：MiR-486是一種新發(fā)現(xiàn)的低氧相關miRNAs，可以通過PTEN-PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)BM-MSCs的生物學特性。
　　第二部分：MiR-486調(diào)控造血細胞增殖、分化及糖代謝的作用及機制。
　　目的：探討miR-486在紅系白血病細胞 TF-

6、1細胞低氧反應中的調(diào)節(jié)作用，及其對 TF-1細胞增殖、分化及糖代謝等生物學特性的影響。
　　方法：⑴將TF-1細胞進行低氧處理，用qRT-PCR檢測 miR-486、pri-miR486、HIF-1α、HIF-2α、Sirt1的表達，用流式細胞儀檢測了TF-1細胞CD235a的表達；⑵用慢病毒感染技術將 TF-1過表達miR-486，用qRT-PCR及Westernblot檢測Sirt1的表達，用qRT-PCR檢測 Glut1、G

7、lut4等糖代謝相關基因的表達，用Dye670染色法及 CCK8法檢測 TF-1的增殖；⑶用慢病毒感染技術將TF-1沉默 miR-486，用qRT-PCR及 Western Blot檢測 Sirt1的表達，用qRT-PCR檢測了Glut1、Glut4等糖代謝相關基因的表達，用Dye670染色法及 CCK8法檢測 TF-1的增殖,用流式細胞儀檢測 TF-1細胞CD235a的表達及紅系分化；⑷用慢病毒感染技術將 TF-1細胞沉默Sirt1后

8、用qRT-PCR及WesternBlot檢測Sirt1的表達，用qRT-PCR檢測了Glut1、Glut4等糖代謝相關基因的表達，用Dye670染色法及CCK8法檢測TF-1的增殖；用流式細胞儀檢測TF-1細胞 CD235a的表達及紅系分化。
　　結果：低氧可以促進TF-1細胞miR-486、pri- miR486、HIF-1α、HIF-2α的表達，抑制 Sirt1的表達；低氧可以促進 TF-1細胞的紅系分化能力；與感染對照病毒的

9、TF-1細胞相比，miR-486過表達抑制TF-1細胞Sirt1的表達，促進 Glut1、Glut4的表達，并可以促進 TF-1增殖；與感染對照病毒的TF-1細胞相比，miR-486沉默后促進TF-1細胞 Sirt1的表達，抑制Glut1和Glut4的表達，抑制 TF-1增殖，抑制 TF-1紅系分化；與感染對照病毒的TF-1細胞相比，Sirt1沉默促進 Glut1和 Glut4的表達，促進 TF-1紅系分化。
　　結論：miR-4