白樺鯊烯合酶和鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆及表達特性研究.pdf

1、學校代碼：10225學號：S16322學位論文白樺鯊烯合酶和鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆及表達特性研究指導教師姓名：申請學位級別：論文提交日期：授予學位單位：尹靜碩士張夢巖東北林業(yè)大學2016年4月東北林業(yè)大學學科專業(yè)：論文答辯日期：授予學位日期：答辯委員會主席：論文評閱人：圣夕厶櫛案大學森林生物工程2016年6月2016年6月摘要摘要白樺三萜具有重要的抗腫瘤和艾滋病毒活性，而白樺三萜重要活性成分(白樺脂醇、齊墩果酸、達瑪烯二醇等)和固醇均來自

2、甲羥戊酸代謝途徑中共同的前體物質2，3氧化角鯊烯。鯊烯合酶(Squalenesyn協(xié)ase，ss)和鯊烯環(huán)氧化酶(Squaleneepoxidase，SE)是直接參與合成2，3氧化角鯊烯的兩個關鍵酶，為三萜代謝途徑中的重要節(jié)點，SS和SE的含量和活性對三萜的合成與積累起著重要的調控作用。本研究以白樺(BetulaPlatyphllasue)為試材，克隆白樺三萜合成途徑關鍵酶BpSS和BpSE基因全長及啟動子序列，并進行生物信息學分析；檢

3、測了不同激素及不同組織中BpSS和BpSE表達模式；同時分別構建了BpSS和BpSE的植物和酵母表達載體，對其在白樺和酵母中的表達特性進行研究，并完成基因定位。以期為為通過基因工程技術及合成生物學途徑促進白樺三萜高效合成奠定基礎，為白樺三萜類物質的生物技術利用提供理論依據和技術支持。本研究結果如下：1以白樺組培苗RNA反轉錄cDNA為模板，應用RACE技術克隆獲得白樺的鯊烯合酶BpSS和鯊烯環(huán)氧酶BpSE基因的cDNA全長，生物信息學分

4、析表明，BpSS基因cDNA全長為1588bp，ORF為1242bp，編碼413個氨基酸，有一個特異的Isoprenoid超家族，包含結構域，并與大豆、甘草等物種船BiosynC1TransIPPSHH的氨基酸序列相似性達85～88％，具有高度同源性。系統(tǒng)進化樹分析顯示，白樺的冊與可可樹的SSl同源性較高，屬于一個分支，次之是豆科的甘草和大豆等，再次之是毛果楊。白樺的肥基因cDNA全長為2040bp，ORF長為1581bp，編碼526個

5、氨基酸，在第209428aa位置具有一個SDR超家族，包含特異的鯊烯環(huán)氧酶結構域(SE)保守區(qū)和輔酶Q結合域(COQ6)，與可可、麻風樹等物種胚的氨基酸序列相似性達82～88％。系統(tǒng)進化樹表明，白樺的艇與南非醉茄、毛曼陀羅的同源性較高，屬于一個分支，與其他植物、動物和人的進化距離依次漸遠。2利用實時定量RTPCR技術，分析了不同組織中以及不同植物激素誘導下BpSS和BpSE基因的表達模式，結果表明，BpSS和BpSE基因均存在組織表達特

6、異性，且表達特征相似，均為葉莖根。MeJA(100tM)、乙烯(5mM)和ABA(109M)不同程度誘導了BpSS和BpSE的表達。卻鼴和BpSE的表達對SA(50mg／L)響應不顯著。構建高效植物表達載體pCAMBIAl303BpSS采用三親雜交的方法，通過瞬時轉化技術，將BpSSGFP融合蛋白轉化到洋蔥表皮細胞使其瞬時表達，結果顯示，在細胞質中發(fā)出綠色熒光，表明BpSS蛋白的表達定位于細胞質中。3利用基因組步移技術，克隆獲得長度為9