早期斷奶仔豬血清代謝組學(xué)研究及谷氨酰胺対日糧消化吸收和代謝的影響.pdf

1、現(xiàn)代化養(yǎng)殖中通常對仔豬采取早期斷奶以提高整個豬場的生產(chǎn)效率，而早期斷奶產(chǎn)生的應(yīng)激對仔豬的生長代謝產(chǎn)生嚴(yán)重影響。本論文在采用代謝組學(xué)方法分析仔豬早期斷奶過程中血清氨基酸代謝譜變化的基礎(chǔ)上，研究谷氨酰胺對仔豬腸道消化吸收功能和機體代謝的影響，并用體外細(xì)胞模型探討了谷氨酰胺抑制腸道上皮氧化凋亡的機理。主要試驗設(shè)計及研究結(jié)果如下:
　　 試驗一:本試驗的主要目的是分析仔豬早期斷奶過程中血清氨基酸代謝譜的動態(tài)變化。選取8頭21日齡斷奶仔豬

2、，在斷奶后0、1、3、5、7、10、15、30 d采集血液樣本用于氨基酸分析。試驗結(jié)果顯示，血清精氨酸與其直接的前體物質(zhì)瓜氨酸和鳥氨酸含量在斷奶后1～5 d內(nèi)顯著下降（P＜0.05），在斷奶后7～30 d上升。亮氨酸、脯氨酸、酩氨酸和牛磺酸在斷奶后1～3 d內(nèi)顯著下降(P＜0.05)，然后其含量上升。異亮氨酸、賴氨酸、甘氨酸和絲氨酸含量在斷奶后5d顯著低于其他時間點的含量，然后在斷奶后7～30 d上升。蛋氨酸含量在斷奶后0～3 d內(nèi)變化

3、較小(P＞0.05)，在斷奶后5d，其含量分別比斷奶后0d、1d和3d增加了41.61％（P＜0.05）、43.51％(P＜0.05)和41.11％(P＜0.05)，之后保持穩(wěn)定。血清蘇氨酸含量在斷奶后3d比斷奶后0d和1d分別增加了31.67％(P＜0.05)和79.06％(P＜0.05)，斷奶后10d其達到最大值，在斷奶后15d和30 d其含量顯著降低。谷氨酸含量（包括谷氨酸+谷氨酰胺）在斷奶后0d、1d和10d顯著低于其他時間段含

4、量(P＜0.05)。總氨基酸含量在斷奶后0d顯著高于斷奶后各時間段總氨基酸含量(P＜0.05)，在斷奶后1～5 d，總氨基酸含量逐漸降低，斷奶后7d起升高并至斷奶后30d無顯著變化（P＞0.05）。主成分分析得分圖顯示，隨著斷奶后時間的延長，血清氨基酸代謝譜與斷奶后0d的代謝譜差異逐漸變大，然后逐漸向斷奶后0d代謝譜位置靠攏，并趨于穩(wěn)定，其中斷后3～5d血清氨基酸代謝譜變化幅度最大。偏最小二乘法判別分析模型顯示，谷氨酰胺和谷氨酸為在NR

5、C(1998)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)下區(qū)分?jǐn)嗄毯蟾鲿r間點血清代謝譜最重要的氨基酸。
　　 試驗二:基于氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法運用于研究仔豬早期斷奶與飼糧中補充L-谷氨酰胺(Gln)對血清代謝物的影響。將36頭21日齡仔豬隨機分成三組，一組繼續(xù)哺乳（哺乳組），另外兩組仔豬進行斷奶處理，分別在其日糧中添加1％ Gln或等氮的L-丙氨酸(Ala)，即為Gln組與對照組。處理7d后采集血清樣本進行研究。結(jié)果顯示，與哺乳組相比，對照組仔豬

6、中有20種代謝物含量顯著下降(P＜0.05)。這些數(shù)據(jù)結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫代謝通路分析表明，早期斷奶引起廣泛的代謝改變，包括精氨酸和脯氨酸代謝、氨基糖和核苷酸代謝、乳糖代謝、甘油磷酸酯代謝、不飽和脂肪酸的生物合成和脂肪酸代謝。飼糧添加Gln能提高仔豬血清肌酐、D-木糖、2-羥丁酸、反式-9-十六烯酸、α-L-呋喃半乳糖含量(P＜0.05)。這些物質(zhì)涉及精氨酸和脯氨酸代謝、碳水化合物代謝和脂肪酸代謝。隨機森林棄一法交叉驗證分析表明，肌酐是三

7、組中最重要的代謝產(chǎn)物。與哺乳組仔豬比較，對照組仔豬血清肌酐濃度降低了754.58％（P=0.00001），Gln添加使其比對照組增加了447.39％(P=0.0003)。斷奶仔豬與哺乳仔豬相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)反映早期斷奶改變機體代謝途徑，導(dǎo)致碳水化合物代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝異常，飼糧中添加Gln可在一定程度上改善仔豬的代謝過程。本試驗為研究仔豬早期斷奶與飼糧添加Gln對機體復(fù)雜的代謝變化提供了新的視角。
　　 試驗三: Gln對斷奶

8、仔豬總腸道表觀消化率（CTTAD）、回腸末端表觀消化率(AID)以及小腸中與營養(yǎng)吸收和能量代謝相關(guān)酶影響的研究至今未見報道，本試驗主要探討了Gln對斷奶仔豬CTTAD、AID、小腸消化吸收相關(guān)因子和Gln及能量代謝酶活力的影響。仔豬21日齡斷奶，分成兩組，為Gln組和對照組，其日糧分別添加1％ Gln（wt∶ wt）和等氮Ala。本研究包括兩個獨立的實驗，分別為實驗一和實驗二，其中實驗一:在斷奶后3、5、10、15、30 d測定日糧組分

9、及能量的總腸道表觀消化率;實驗二:在10和30 d比較兩組仔豬的生長性能、AID、空腸酶活力、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和過氧化物酶體增殖體激活受體-γ（PPARγ）和丙酮酸激酶(PK)基因表達差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn):日糧添加Gln顯著提高干物質(zhì)、有機物、總能和氨基酸的總腸道表觀消化率(P＜0.05)，且總腸道表觀消化率隨著斷奶后時間的延長顯著提高(P＜0.05)。在整個實驗階段，Gln組平均日增重增加了12.40％(P=0.049)。

10、在斷奶后10d，日糧Gln組總能、亮氨酸、賴氨酸、胱氨酸和脯氨酸回腸表觀消化率分別提高了12.50％(P=0.047)、7.03％（P=0.041）、5.95％（P=0.036）、9.30％（P=0.025）和11.17％（P=0.009）;在斷奶后30d，脯氨酸回腸表觀消化率提高了6.11％(P=0.044)?？漳c刷狀緣堿性磷酸酶活力在斷奶后10d和30 d分別提高了30.36％(P=0.048)和6.21％(P=0.30)。與對照組

11、比較，在斷奶后10d和30d，Gln組PPARγ mRNA含量分別下降了10.85％（P=0.14）和41.88％（P=0.023）;mTOR mRNA含量分別增加了22.10％(P=0.061)和22.28％(P=0.042)。Gln組谷氨酰胺合成酶活力在斷奶后10d下降了48.89％(P=0.044)，PK活力在斷奶后30 d下降了13.13％(P=0.036)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力在斷奶后30 d表現(xiàn)為升高的趨勢（P=0.076）。PK

12、 mRNA水平在斷奶后10d和30 d分別下降了29.75％(P=0.062)和44.40％(P=0.039)。結(jié)果提示，飼糧添加1％ Gln提高日糧組分總腸道表觀消化率和回腸末端表觀消化率，改善小腸消化吸收能力，調(diào)節(jié)空腸中Gln代謝和能量代謝相關(guān)酶活力。
　　 試驗四:本試驗旨在研究仔豬日糧中添加1％ Gln對仔豬血清代謝譜的影響，以及對肝臟代謝的調(diào)節(jié)作用。16頭健康的21日齡斷奶仔豬隨機分成兩組:Gln組和對照組，其日糧分別

13、添加1％ Gln（wt∶ wt）和等氮Ala。處理30d后，采集血清樣本研究其代謝物變化。另外，每組屠宰4頭仔豬收集肝臟樣本，分析其代謝調(diào)節(jié)酶活力和基因表達。結(jié)果顯示:與對照組比較，Gln組仔豬血清有12種代謝物濃度發(fā)生了顯著變化(P＜0.05)，包括碳水化合物、氨基酸、脂肪酸。這些數(shù)據(jù)結(jié)合KEGG代謝通路分析表明，對照組和Gln組仔豬在碳水化合物代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、酪氨酸代謝和甘油磷酸酯代謝方面均有很大的差異。隨機森林棄一法交叉

14、分析驗證分析表明，脯氨酸是12種顯著性差異代謝物中對兩組分開貢獻率最大的代謝物。主成分分析顯示，對照組和Gln組在得分圖中各自分開聚集。Gln組仔豬肝臟丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和己糖激酶的活力分別比對照組增加了26.77％(P=0.026)和26.18％(P=0.004)，PK降低了29.08％（P=0.001）;PKmRNA水平降低66.10％(P=0.034)。mTOR和PPAR-γ mRNA水平在兩組中無顯著差異(P＞0.05)。基于Gln組

15、和對照組數(shù)據(jù)進行相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)分析，說明飼糧Gln處理改變了早期斷奶仔豬的碳水化合物、脂類和氨基酸代謝。
　　 試驗五:本試驗旨在分析Gln對氧化損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。采用0.35 mMH2O2處理HT-29細(xì)胞，在無Gln的DMEM培養(yǎng)基中加入Gln，使Gln終濃度分別為0 mM（對照組）、0.5 mM、2mM和10mM。在12h后，SOD活性和MDA含量在不同濃度Gln作用下無顯著差異(P＞0.05)。在24 h后，對照組S

16、OD活力顯著低于0.5 mM和2 mM Gln組(P＜0.05)。在32 h后，0.5 mM、2mM和10 mM Gln組SOD活力與對照組比較，分別升高了46.40％、67.99％和19.71％;MDA含量分別減少了17.79％、37.66％和13.09％。0.5 mM和2 mM Gln減少FAS、Caspase-3、NF-kB和Bax基因表達(P＜0.05)，增加Bcl-2基因表達(P＜0.05)。在32 h后，10 mM Gln促

17、進FAS、Caspase-3、NF-kB和Bax基因表達(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，在24h后，Gln使活細(xì)胞數(shù)量提高了5.32％～11.97％;在32 h后，活細(xì)胞數(shù)量提高了1.39％～7.63％。結(jié)果提示，Gln可提高細(xì)胞抗氧化能力和促進抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達，降低細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達，從而阻止氧化損傷誘導(dǎo)的腸道細(xì)胞凋亡。
　　 綜上所述，早期斷奶影響仔豬體內(nèi)氨基酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)代謝。飼糧中添加1％谷