棉籽蛋白發(fā)酵制備ACE抑制肽.pdf

1、棉籽蛋白是一種重要的植物蛋白質(zhì)資源,其氨基酸種類齊全,比例適當(dāng),價格低廉,是一種高質(zhì)量的食物和飼料用蛋白。棉籽榨油得到的棉籽粕含有豐富的棉籽蛋白,但由于棉酚的存在,嚴重影響了棉籽蛋白的開發(fā)利用,僅有少量棉籽蛋白用于飼料添加。隨著脫毒技術(shù)的發(fā)展和無毒棉的培育成功,給棉籽蛋白的應(yīng)用開發(fā)提供了很好的發(fā)展前景。利用脫毒的棉籽蛋白制備有生理功能的活性多肽,用于保健食品和藥品,不但對增進人類健康有著重要作用,也對延長棉花加工的產(chǎn)業(yè)鏈有著重要的意義。

2、目前使用微生物發(fā)酵法制備棉籽蛋白ACE抑制肽的深入研究尚未見到詳細報道。本論文以脫酚棉籽蛋白為原料,分離篩選高效安全的生產(chǎn)菌株,發(fā)酵制備ACE抑制肽,通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化,提高棉籽發(fā)酵液中ACE抑制肽的含量,最后使用超濾、凝膠層析和反相高效液相色譜對發(fā)酵液中的ACE抑制肽進行分離純化,并鑒定ACE抑制肽的氨基酸序列,為棉籽蛋白的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。主要結(jié)果如下:
　　 1.從分離到的乳酸菌和芽孢桿菌中篩選出產(chǎn)蛋白酶的菌株

3、,根據(jù)菌株對棉籽蛋白的水解能力以及發(fā)酵液的ACE抑制率,選擇最適的發(fā)酵菌株。結(jié)果表明,從選用的泡菜汁中獲得了4株乳酸菌,分別標記為L1～L4。通過觀察這4株乳酸菌和枯草芽孢桿菌NCT314酪蛋白水解圈的有無可以發(fā)現(xiàn),除了乳酸菌L3之外,其余4株菌都可以產(chǎn)生蛋白酶。將產(chǎn)蛋白酶的菌株接種到棉籽蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵,檢測結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌NCT314發(fā)酵棉籽蛋白發(fā)酵液的水解度和ACE抑制率為最高,分別為18.36％和64.86％。因此

4、選擇枯草芽孢桿菌NCT314作為棉籽蛋白ACE抑制肽的發(fā)酵菌株。
　　 2.以脫酚棉籽蛋白為原料,以枯草芽孢桿菌NCT314為發(fā)酵菌,對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。首先以水解度和 ACE抑制率為指標,進行了不同發(fā)酵時間(0、6、12、20、22、24、26、30、36、48、60 h)、不同發(fā)酵溫度(27、30、32、35、37、40、42、47℃)、不同pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)和不同接種量(1％、3％、5％、7

5、％、9％)的單因素試驗,結(jié)果表明,當(dāng)發(fā)酵時間為24 h,發(fā)酵溫度為32℃,pH為7.0,接種量為5％時,棉籽蛋白發(fā)酵液ACE抑制肽的產(chǎn)量可達到最好。在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,以發(fā)酵液ACE抑制率為響應(yīng)值,選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和pH這三個影響顯著的因素,設(shè)計響應(yīng)面試驗。通過響應(yīng)面試驗對以上發(fā)酵條件的優(yōu)化,得到最佳發(fā)酵條件為:溫度32.08℃、時間22.6 h、pH為7.2,若在此發(fā)酵條件下,發(fā)酵液的ACE抑制率最高可達78.06％。

6、r>　　 3.對發(fā)酵液中的ACE抑制肽進行了分離純化。將棉籽蛋白發(fā)酵液中的ACE抑制肽經(jīng)超濾、凝膠層析(Sephadex G-25)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離純化。結(jié)果表明,棉籽蛋白發(fā)酵液經(jīng)超濾分離后可分為4個組分,分別是U1(>30 kDa)、U2(30～10 kDa)、U3(10～5 kDa)和U4(<5 kDa)。其中,U4組分具有較強的ACE抑制能力,其IC50為0.94 mg／mL。U4組分經(jīng)Sephadex

7、G-25分離后可得到3個洗脫峰,分別標記為S1、S2和S3。通過測定各洗脫峰的ACE抑制活性可知,組分S2的ACE抑制能力最強,IC50可達0.19 mg／mL。使用制備型RP-HPLC可進一步將S2分成5個峰組分,分別編號為1～5號,收集各峰組分,經(jīng)測定,4號峰組分具有較強的ACE抑制能力,其ACE抑制率可達83.77％。后經(jīng)分析型RP-HPLC純度鑒定,4號峰組分只含有一個肽段。最后,4號峰是一個由五個氨基酸連接成的肽段,其分子量為