雞白痢雞傷寒門氏菌酶免疫傳感器的研究.pdf

1、致病微生物感染對畜禽類健康和人類食品安全造成普遍、廣泛而嚴重的影響。在禽類養(yǎng)殖業(yè)中，雞白痢和雞傷寒是由雞白痢沙門氏菌(Salmonellapullorum，S.pullorum)和雞傷寒沙門氏菌(Salmonellagallinarum，S.gallinarum)感染引起的對雞類健康威脅最大的兩種傳染性敗血癥。該病傳播力強、污染嚴重、給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，同時對作為人類食品的禽類產(chǎn)品的安全威脅也是非常大的，引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。加

2、強對這兩種致病菌的檢測是非常有必要的。準確、簡便、經(jīng)濟的快速檢測方法是疾病的預(yù)防控制和食品的安全保障所急需的。目前，對這兩種細菌的檢測有標準方法和快速檢測方法，這些方法各有優(yōu)點和不足。人們不斷探索和追求新的快速檢測技術(shù)，以期獲得更好的檢測效果。
　　 電化學(xué)酶免疫傳感器是將酶和電化學(xué)的雙重放大作用與免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合，具有設(shè)備簡單、使用方便、方法靈活、體系易集成化、微型化等優(yōu)點，其檢測效果優(yōu)于一般的免疫傳感器。電化學(xué)酶免疫傳

3、感技術(shù)發(fā)展至今，電極的選擇，固定生物組分活性和穩(wěn)定性的維持以及免疫結(jié)合物反應(yīng)信號的改善和放大等關(guān)鍵環(huán)節(jié)已經(jīng)有了長足的改善，但也還沒有達到理想的程度，尚需進一步的研究改進。因此，本文欲在這幾個方面對酶免疫傳感器進行研究和改進，探索研究新型的更好的快速檢測雞白痢雞傷寒沙門氏菌的酶免疫傳感器。
　　 本論文主要進行了以下幾項研究工作:
　　 1、基于多壁碳納米管/明膠-海藻糖復(fù)合物/4-SPCE的雞白痢雞傷寒沙門氏菌的酶免疫傳

4、感器的研制
　　 本研究利用明膠聚合物與海藻糖制成混合水溶液，用于分散具有高導(dǎo)電性、電子傳遞等優(yōu)良特性但不易分散的多壁碳納米管，并將辣根過氧化物酶標記的雞白痢雞傷寒沙門氏菌抗體(horseradishperoxidase-labeledanti-Salmonellapullorum&Salmonellagallinarum,HRP-anti-S.pullorum&S.gallinarum)包埋固定于該多壁碳納米管/明膠-海藻糖復(fù)

5、合物修飾的四通道絲網(wǎng)印刷碳電極上，制成新型雞白痢雞傷寒沙門氏菌酶免疫電極，以期在靈敏度和穩(wěn)定性方面有所改進。利用原子力顯微鏡表征修飾電極的表面形態(tài)，采用循環(huán)伏安法對此酶免疫電極進行電化學(xué)表征，對S.pullorum&S.gallinarum進行快速檢測和對免疫電極的性能進行測定。結(jié)果表明，在優(yōu)化的檢測條件下，酶免疫電極對目標菌的線性響應(yīng)范圍為103～109cfu/mL，檢出限為6.42×102cfu/mL(S/N=3)，4℃放置28d后

6、，其響應(yīng)電流為初始值的89.6％，具有良好的穩(wěn)定性、特異性、重現(xiàn)性和準確性。該制備方法簡便、靈敏、穩(wěn)定、經(jīng)濟、可操作性強，具有一定的潛在應(yīng)用價值。
　　 2、基于離子液體[BMIM]PF6/多壁碳納米管/海藻酸鈉-羧甲基殼聚糖復(fù)合物/4-SPCE的雞白痢雞傷寒沙門氏菌的酶免疫傳感器的研制
　　 本研究利用海藻酸鈉和羧甲基殼聚糖復(fù)合物分散電特性好的多壁碳納米管，與性能優(yōu)異的離子液體[BMIM]PF6共同將HRP-anti-

7、S.pullorum&S.gallinarum固定于四通道絲網(wǎng)印刷碳電極上，制成具有雙重放大響應(yīng)信號的檢測S.pullorum&S.gallinarum的酶免疫傳感器。用原子力顯微鏡表征其表觀形態(tài)，循環(huán)伏安法監(jiān)測其電化學(xué)特性。結(jié)果表明，在優(yōu)化的檢測條件下，免疫電極對目標菌的線性響應(yīng)范圍為103～109cfu/mL，檢出限為3.93×102cfu/mL(S/N=3)，4℃放置28d后，響應(yīng)電流為初始值的90.15％，具有良好的穩(wěn)定性、特異

8、性、重現(xiàn)性和準確性。多壁碳納米管與離子液體結(jié)合制備的雞白痢雞傷寒沙門氏菌酶免疫傳感器實現(xiàn)了檢測信號的雙重放大，檢測靈敏度高，離子液體有助于保持酶標抗體的活性，增強其穩(wěn)定性，延長免疫電極的有效時間。該方法對其它分析物的酶免疫傳感器的構(gòu)建有一定的參考及潛在應(yīng)用價值。
　　 3、基于鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)/電沉積納米金/4-SPCE的雞白痢雞傷寒沙門氏菌的酶免疫傳感器的研制
　　 本研究利用電沉積納米金給四通道絲網(wǎng)印刷碳電極鍍

9、上一層電活性層，吸附上鏈霉親和素，再與生物素化雞白痢雞傷寒沙門氏菌抗體(biotinylatedanti-S.pullorum&S.gallinarum,bio-anti-S.pullorum&S.gallinarum)高親和力地結(jié)合形成鏈霉親和素-生物素多級放大系統(tǒng)，通過抗原抗體免疫反應(yīng)將S.pullorum&S.gallinarum及HRP-anti-S.pullorum&S.gallmarum固定到電極上，構(gòu)建新型雞白痢雞傷寒沙門

10、氏菌酶免疫傳感器。采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)交流阻抗法表征層層修飾的電極，利用循環(huán)伏安法對目標菌雞白痢雞傷寒沙門氏菌進行檢測。結(jié)果表明，電沉積納米金促進了電子傳遞，增強了電極的導(dǎo)電性，簡化了納米金的修飾過程并提高其固定的穩(wěn)定性。高親和力的鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)增加了免疫分子的固定量，對免疫分子的固定可能有一定的定向效果。在上述修飾材料的雙重作用下，該酶免疫傳感器的電流響應(yīng)信號大大增強。在優(yōu)化的檢測條件下，免疫電極對目標菌的線性響應(yīng)范圍為10