轉(zhuǎn)基因細胞法測定重組藥物生物學活性研究.pdf

1、生物學活性測定在重組藥物的研究開發(fā)和質(zhì)量控制中至關(guān)重要。目前的生物活性分析方法主要包括體內(nèi)法（動物實驗）和體外法（細胞與組織實驗）?；诩毎姆治龇椒ㄓ捎谄渚哂胁僮骱啽?，周期短，特異性好，變異度小等優(yōu)點得到廣泛應(yīng)用。但許多重組藥物由于藥物作用的組織器官特異性，往往難以獲得適用于活性測定的穩(wěn)定的高反應(yīng)性細胞株，而通過人工改造的轉(zhuǎn)基因細胞可以解決這一難題。
　　本研究的目的是構(gòu)建活性測定轉(zhuǎn)基因細胞技術(shù)平臺并應(yīng)用于重組藥物的生物學活性測

2、定方法研究，以解決特定重組藥物的測活難題。本研究內(nèi)容共分為三部分，分別根據(jù)特定藥物的具體作用機制采用了不同的策略構(gòu)建活性測定用轉(zhuǎn)基因細胞株。第一部分，導入天然受體的轉(zhuǎn)基因細胞活性測定方法的建立和應(yīng)用。腦利鈉肽與其天然受體鳥苷酸環(huán)化酶A（GCA）結(jié)合后，可激活其胞內(nèi)區(qū)的鳥苷酸環(huán)化酶活性，催化GTP轉(zhuǎn)化為cGMP。構(gòu)建GCA超表達的293GCAC3單克隆細胞株，通過檢測cGMP含量的來測定重組人腦利鈉肽的生物學活性。結(jié)果表明，該方法較傳統(tǒng)的

3、兔主動脈條法操作簡便，周期短，變異小，可以作為一種有效的替代方法用于重組人腦利鈉肽的生物活性分析。第二部分，同時導入天然受體和報告基因的轉(zhuǎn)基因細胞活性測定方法的建立與應(yīng)用。Byetalog與 GLP-1受體結(jié)合后，可提高細胞內(nèi)cAMP水平，最終激活cAMP反應(yīng)元件（CRE），增強下游基因的表達。構(gòu)建GLP-1受體和CRE報告基因共轉(zhuǎn)染的CHOglp1r/crec14單克隆細胞株，通過檢測報告基因的表達來測定Byetalog的生物學活性。

4、結(jié)果表明，該方法操作簡便快速，變異度小，適用于Byetalog的生物學活性測定。第三部分，同時導入融合受體和報告基因的轉(zhuǎn)基因細胞活性測定方法研究。構(gòu)建VEGFR胞外區(qū)和IFNAR1/2胞內(nèi)區(qū)的融合受體，與IFN反應(yīng)元件（ISRE）報告基因共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，VEGF與胞外區(qū)的VEGFR結(jié)合后激活胞內(nèi)的IFN信號通路，引起ISRE報告基因高表達，可以通過檢測VEGF單抗對報告基因表達的抑制作用來測定其活性。成功構(gòu)建了融合受體和ISRE