乙型肝炎病毒X蛋白誘發(fā)肝細胞惡性轉化機制的定量蛋白組學研究.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內惡性腫瘤中發(fā)病率居第五、致死率居第三的惡性疾病。每年全世界約有700，000例新增患者，其中男性發(fā)病率遠遠高于女性，且主要集中于東南亞地區(qū)以及非洲撒哈拉沙漠以南區(qū)域，呈現(xiàn)顯著的地域性分布。中國大陸地區(qū)HCC患者數(shù)量占全世界患者數(shù)量的50％，其中男性發(fā)病率為35.2/100，000，女性發(fā)病率為13.3/100，000。病因學統(tǒng)計顯示54％的HCC患者與

2、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染關系密切。雖然HBV疫苗的強制接種使目前中國HBV病毒感染者數(shù)量由9.75％降到7.18％，但由于人口基數(shù)龐大以及已有感染者發(fā)生HCC的滯后效應等因素的影響，HBV患者的治療和預防依然是中國社會亟待解決的公共衛(wèi)生安全問題。
　　HBV基因編碼四種蛋白，包括表面抗原HBsAg、核心區(qū)蛋白(HBeAg和HBcAg)、病毒DNA聚合酶HBp以及HBx。其中HBx是一種多功能的

3、病毒調節(jié)因子，具有促進肝細胞轉化為肝細胞癌的功能。近年來通過酵母雙雜交、染色質免疫共沉淀、表達譜芯片分析以及蛋白質免疫共沉淀等技術發(fā)現(xiàn)HBx主要參與調節(jié)病毒與宿主細胞基因的轉錄、信號轉導途徑和蛋白質降解水平等多個生物學過程，進一步證實了HBx基因功能的復雜性和多樣性。盡管在HBx基因功能研究中取得較大成績，但是在研究的策略、實驗模型以及模型的疾病狀態(tài)方面存在諸多不足。主要體現(xiàn)為研究策略局限于局部的信號或代謝通路，缺乏系統(tǒng)性、整體性的分析

4、，或者僅有基因mRNA水平的系統(tǒng)評價，缺少蛋白質水平的系統(tǒng)分析;實驗模型多以患者組織樣本或體外培養(yǎng)的細胞系為主，忽視了細胞微環(huán)境和遺傳異質性等要素對于HBx致病機制研究的干擾。此外，HBx引發(fā)的從肝臟炎癥并發(fā)展至癌癥的進程中的作用機制并沒有得到清晰的闡釋。
　　本研究旨在利用高覆蓋、高精度的定量蛋白質組學技術探索HBx誘發(fā)小鼠肝臟炎癥向癌癥轉化的病理生理學機制。研究依托HBx轉基因致肝癌小鼠模型，選擇分別代表HBx誘發(fā)的肝臟炎癥與

5、癌癥病理狀態(tài)的12個月(12M)和24個月(24M)的組織作為實驗材料，以HBx轉基因小鼠的同窩正常小鼠作為實驗對照，以避免遺傳背景和外界環(huán)境對HBx基因功能研究的干擾。選用實驗室制備的重穩(wěn)定性同位素標記氨基酸完全標記的小鼠作為定量內標，實現(xiàn)高精度蛋白質組定量。同時，通過蛋白質免疫共沉淀技術結合蛋白質組學技術，篩選與HBx發(fā)生相互作用的關鍵分子。以“與HBx相互作用蛋白”為中心點結合定量蛋白組學數(shù)據，重構“HBx-結合蛋白-信號效應”的

6、HBx網絡調控圖。
　　本研究在國內首次發(fā)展了用于小鼠模型的SILAC整體標記方法。利用含有重穩(wěn)定性同位素標記賴氨酸([13C6]-Lysine)的SILAC鼠糧飼養(yǎng)C57BL/6小鼠，實現(xiàn)代謝過程中的小鼠蛋白質組高標記。對不同器官組織樣品進行標記效率的LC-MS/MS定量分析，證明F2代小鼠的整體標記效率達到95％以上。其中用于HBx小鼠實驗中的F2代SILAC小鼠肝臟標記效率達到96.34％±0.90％，這為高精度定量蛋白質組

7、學研究創(chuàng)造了條件。
　　在蛋白質-蛋白質相互作用研究中，我們共鑒定到162個與HBx相互作用的蛋白。GO分析顯示這些蛋白質涉及細胞骨架重構、線粒體組份、脂代謝、轉錄調控、細胞周期調控和RNA可變剪接等諸多過程。其中47個已經被以前的研究證實，占鑒定的162個相互作用蛋白的近30％，顯示了蛋白質組學在研究蛋白質-蛋白質相互作用中的可行性。剩余的115個蛋白質為首次鑒定的和HBx相互作用的蛋白質，體現(xiàn)了我們蛋白質組檢測平臺的靈敏度和高

8、覆蓋蛋白質組技術的優(yōu)勢。在這162個HBx相互作用蛋白中，最大的群體是細胞骨架相關蛋白。共有37個蛋白質屬于這個類群，包括肌凝蛋白MYL6B、肌動蛋白相關蛋白ACTR3B、連環(huán)蛋白β-catenin、驅動蛋白KIF11和KIF5C、血管抑素結合蛋白AMOT、肌動蛋白結合蛋白SVIL等。這些蛋白可通過復雜的相互作用促進細胞增殖，影響細胞遷移、管狀結構的形成以及偽足的數(shù)量等，并進而影響血管生成。第二大蛋白質類群是與線粒體功能活動關系密切的相

9、互作用蛋白，共32個，包括谷氨酰胺環(huán)化酶γGGCT、脫氧尿苷三磷酸酶DUT、腺嘌呤磷酸核糖轉移酶APRT、Ca2+的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族分子CAMK2D等。這些蛋白質參與核酸和氨基酸代謝、RNA可變剪接等生物學過程。特別值得關注的是HBx不僅可與β脂肪酸氧化進程中的脂肪酰輔酶A合成酶ACSF2和脂肪羥酰輔酶A脫氫酶家族成員HADH等2個限速酶發(fā)生相互作用，而且還與酯酶分子甾醇載體蛋白SCP2、胰腺三酰甘油脂肪酶PNLIP和脂鈣蛋白

10、酶LCN1發(fā)生相互作用，從而干擾肝細胞脂代謝過程。這可能是HBV介導肝臟脂肪化和炎癥的主要原因。
　　在HBx轉基因小鼠的蛋白質組研究中，我們共鑒定了4744個蛋白質，其中從12MHBx、24M HBx組及其同窩小鼠中分別鑒定了3491、3464和3442、3298(FDR＜1％)個蛋白質，四組樣品中共同鑒定的蛋白質有2504個(FDR＜1％)。在定量研究方面，12MHBx和12M WT組定量分析的蛋白質有2816個，定量數(shù)據的對

11、數(shù)值整體呈現(xiàn)正態(tài)分布，其SD值為0.20;24M HBx和24 M WT組定量分析的蛋白數(shù)目為2731個，定量數(shù)據整體分布的SD值為0.42。24M HBx組SD值與12M HBx組SD值相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明在HBx介導的從炎癥向癌癥發(fā)生的進程中，肝臟組織的異質性在逐漸增加。以2.0倍差異作為生物學差異蛋白的篩選標準，我們在12M HBx組樣品中鑒定了22個差異表達蛋白，其中15個呈現(xiàn)上調趨勢，7個呈現(xiàn)下調趨勢

12、;在24M HBx組發(fā)現(xiàn)97個差異表達蛋白，其中72個上調，25個下調。差異蛋白質的GO分析顯示在12M HBx階段肌肉組織發(fā)育等功能顯著異常，這可能與肝臟星狀細胞活化引發(fā)細胞外基質纖維化相關;24M HBx結果顯示氧化還原、肌肉組織發(fā)育、轉錄活性、細胞骨架組成、糖代謝、脂代謝、小G蛋白信號途徑等生物學進程顯著富集。尤其是12M和24M HBx介導小鼠肝臟由炎癥向癌癥發(fā)展的過程中，我們分別鑒定了與CDC42信號途徑相關的3個和15個蛋白

13、質表達上調，這提示CDC42信號途徑激活可能是HBx介導肝臟炎癥向癌癥發(fā)展的主要原因。在12MHBx炎癥組織中,雖然沒有發(fā)現(xiàn)線粒體功能紊亂的線索，但觀察到4個與脂代謝關系密切相關的蛋白如ADFP、DHTKD1、AKR1C18和CES2表達變化。當HBx介導肝臟由炎癥進入癌癥階段，18個線粒體功能相關蛋白如NDUFA5、LDHD、IVD和DHTKD1等表達變化顯著。線粒體是細胞脂肪代謝的主要場所之一，研究結果暗示脂肪代謝紊亂和線粒體功能失

14、調可能也是HBx引發(fā)肝臟炎癥進展到癌癥的主要原因。
　　將HBx相互作用蛋白質組與定量蛋白質組學數(shù)據整合，我們發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據在HBx轉染累及的細胞骨架和線粒體功能方面具有很好的一致性。我們據此提出“HBx引發(fā)細胞骨架重塑和線粒體功能失調擾亂肝細胞脂代謝過程，誘發(fā)肝臟由炎癥向癌癥轉化”的假設，并通過免疫組織化學和蛋白印跡實驗等進行了驗證，進一步說明了我們定量蛋白組學研究結論的正確性。
　　在此基礎上，我們從HBx誘發(fā)小鼠肝臟炎癥

15、和癌癥階段呈現(xiàn)相似差異的蛋白質中篩選獲得了與細胞骨架和脂代謝關系密切的絲切蛋白(Cofilin-1，CFL1)和脂肪分化相關蛋白(Adipose differentiation-related protein，ADFP)作為肝病發(fā)生和發(fā)展的候選生物標志物分子進行了深入研究。利用免疫組織化學分析臨床HBV-HCC和非HBV-HCC肝癌組織樣本中的CFL1和ADFP的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)CFL1和ADFP在HBV-HCC肝癌組織中的表達水平明

16、顯高于非HBV-HCC，顯示了CFL1和ADFP具有作為生物標志物所必需的保守性和組織特異性。按照肝癌早期預警與診斷標志物應具備特異性高、敏感、重現(xiàn)性好和患者依從性優(yōu)等要素，我們又進一步分析了HBV、HBV-HCC和HCV等患者的血清樣本中CFL1和ADFP的蛋白質豐度，發(fā)現(xiàn)在HBV以及HBV-HCC患者血清中ADFP的豐度顯著升高，而CFL1在血清中未被檢測到。因此，ADFP可作為HBV誘發(fā)肝細胞癌早期預警及診斷的潛在標志物。

17、　　綜上所述，本研究依托實驗室的高覆蓋和高精度定量蛋白組學研究技術平臺，以HBx轉基因鼠為基因功能研究模型和SILAC小鼠作為蛋白組學定量內標，深入系統(tǒng)地開展了HBx的功能蛋白質組學研究，揭示了HBx通過誘發(fā)細胞骨架重塑和干擾線粒體功能引起肝炎向肝癌發(fā)展的分子機制。在此基礎上，通過對大量臨床樣本的研究進一步證實ADFP可能是HBV誘發(fā)的肝細胞癌的早期預警及診斷標志物，不僅豐富了HBx的生物學功能及其引發(fā)肝病發(fā)生和發(fā)展的分子機制，也為HB