抗癌皂苷C-K的酶轉化研究.pdf

1、現(xiàn)代大量藥理研究證實，五加科植物如人參、三七、西洋參等的攝入對抑制腫瘤的生長具有明顯的作用，且這些植物的抗癌活性是通過它們體內含有的特殊活性成分-達瑪烷型三萜皂苷中的稀有次生皂苷成分(人參皂苷-Rg3、人參皂苷-Rh1和人參皂苷-Rh2等)及經人體腸道菌代謝后的產物-人參皂苷CompoundK(以下簡稱C-K)實現(xiàn)的。C-K無論在體內，還是體外均具有良好的抑制癌細胞生長作用和抗癌細胞轉移作用，因此，是一種很好的潛在抗癌藥物。 通

2、常，天然活性化合物的含量極低，如在紅參中人參皂苷-Rh2僅為十萬分之一，很難滿足新藥研究和臨床用藥的需求。常規(guī)的酸堿水解方法不僅污染生態(tài)環(huán)境，而且危害人體健康。但利用酶或微生物的生物轉化方法可以解決上述問題。利用酶技術對人參皂苷的結構進行改造，即可以保持原有皂苷母核的結構不變，又可以獲得活性更高的次生苷。酶轉化條件溫和、反應具有專一性、產物容易處理，所以，酶技術是對環(huán)境友好的技術。 本研究以應用較廣泛的工業(yè)酶制劑轉化皂苷糖基，制

3、備抗癌活性皂苷C-K為目標，采用三七莖葉、西洋參果等7種植物總皂苷，主要研究了最佳轉化酶制劑的篩選、最佳酶轉化條件的確定、轉化產物的分離與鑒定、探討了C-K的生成途徑。研究結果證明：利用β-葡聚糖苷酶對價格相對低廉的植物總皂苷進行轉化制備C-K的方法是可行的，為C-K的工業(yè)化生產提供了一種新途徑。本研究獲得的結果如下：對C-K制備方法的研究結果表明：酸、堿對植物總皂苷的水解作用位點主要是皂苷的C-20位，產物是相應的次級皂苷-人參皂苷-

4、Rg1、-Rg3、-Rh1、-Rh2及少量的原人參二醇；酶對植物總皂苷的作用位點主要是皂苷的C-3位，其主要產物是C-K。所以，C-K只能通過生物轉化方法獲得。 首次利用工業(yè)酶制劑β-葡聚糖苷酶(β-Glucanase)、纖維二糖酶(Cellobiase)、糖化酶(Glucoamylase)和纖維素酶(Cellulase)轉化7種植物總皂苷的糖基，研究發(fā)現(xiàn)β-Glucanase對三七莖葉總皂苷的轉化作用最強。 在β-Gl

5、ucanase轉化三七莖葉總皂苷制備C-K的研究中，以抗癌活性成分C-K的含量為檢測和評價指標，利用高壓液相色譜法(HPLC)，在單因素實驗的基礎上，通過正交實驗確定了β-Glucanase轉化三七莖葉總皂苷制備C-K的最佳條件為：酶的體積分數(shù)為20％，pH5.4，55℃水浴中加熱48h，可獲得88.30mg/g的C-K，相對標準差(RSD)為1.04％。 利用D101大孔吸附樹脂技術(國家“十五”期間重點支持和推廣項目的提取與

6、分離純化關鍵技術之一)和現(xiàn)代層析技術富集、純化、分離酶轉化產物，經理化常數(shù)和光譜鑒定，確定它們分別是化合物Ⅰ：20(S)原人參二醇20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即人參皂苷CompoundK(C-K)；化合物Ⅱ：20(S)原人參二醇20-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→6)β-D-吡喃葡萄糖苷(人參皂苷-Mc)；研究了β-Glucanase對三七皂苷-Fe和人參皂苷-Mc的酶轉化動力學曲線與轉換途徑，確定β-Glucanase對皂苷作用

7、的專屬性，即β-Glucanase只對與皂苷C-3位相連的β-D-吡喃-葡萄糖基和與皂苷C-20位相連的β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)糖苷鍵的二糖和三糖起作用，對其他類型的糖苷鍵不起作用。 利用β-Glucanase對我國吉林產的西洋參果總皂苷進行轉化的研究中發(fā)現(xiàn)，β-Glucanase轉化西洋參果總皂苷生成C-K的最佳轉化條件為：20mg/mL底物濃度、10％的酶體積分數(shù)、pH為5.4，50℃水浴48小時；C-K的平均生成量為

8、51.59mg/g，RSD為2.26％。該條件與β-Glucanase轉化三七莖葉總皂苷的最佳條件基本一致，但C-K的平均生成量少于對三七莖葉總皂苷的轉化。 利用從我省某種植人參的土壤中篩選出的微生物對三七莖葉總皂苷進行轉化，發(fā)現(xiàn)有2種微生物具有轉化作用，C-K的生成量分別是17.89mg/s(菌株A8)；3.77mg/g(菌株M14)。微生物的轉化作用小于酶的轉化作用。 利用β-Glucanase轉化三七莖葉總皂苷生成