細(xì)胞因子緩釋微球聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病療效評(píng)價(jià)及MRI在體示蹤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：制備血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子明膠微球并評(píng)價(jià)其緩釋性能。 方法：以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微球。20％的明膠溶液滴加于橄欖油中攪拌至形成乳濁液，丙酮固化，異丙醇懸浮后以不同孔徑篩網(wǎng)篩分。離心干燥后，戊二醛交聯(lián)，清洗后冷凍干燥，得淡黃色明膠微球。鈷60照射滅菌。將微球浸泡于磷酸鹽緩沖液中24小時(shí)，微球充分溶脹后，以顯微鏡自帶軟件測(cè)量微球粒徑。取滅菌凍干明膠微球9mg，平均分成3組，將1.5μCi125I—VEGF溶于30μlPB

2、S中，平均滴加于3組明膠微球，4℃過(guò)夜。PBS離心洗滌2次。將微球重懸于2mlPBS中，于r—計(jì)數(shù)器檢測(cè)總放射性強(qiáng)度。之后將重懸的微球置于37℃恒溫?fù)u床中，每24h全量更換溶出液。以r—計(jì)數(shù)器檢測(cè)各時(shí)點(diǎn)微球中的剩余放射性強(qiáng)度，繪制釋放曲線。昆明小鼠42只，隨機(jī)分為14組，每組3只。取明膠微球凍干粉126mg，平均分為42份，將21μCi125I—VEGF溶于420μlPBS中，平均滴加于每份明膠微球，4℃過(guò)夜。將每份微球重懸于100μl

3、PBS中，注射于小鼠左后肢皮下組織中。每24h處死一組小鼠，剪取左下肢，以r—計(jì)數(shù)器檢測(cè)組織中的剩余放射性強(qiáng)度。以每組放射性強(qiáng)度的平均值繪制125I—VEGF釋放曲線。 結(jié)論：明膠微球包載VEGF后能夠?qū)崿F(xiàn)VEGF的緩慢釋放。 目的：探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)緩釋明膠微球能否誘導(dǎo)缺血心肌血管新生。 方法：以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微

4、球，并以1，1’—雙十八烷—3，3，3’，3’—四甲基—吲哚—羧花青—高氯酸鹽(Dil)熒光標(biāo)記。中華小型豬18頭，按照隨機(jī)化表將動(dòng)物分為VEGF緩釋微球移植組、空載微球移植組及對(duì)照組。開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制備小型豬心梗模型。心肌梗死模型建立后14d磁共振檢查后行二次開胸，暴露左室前壁近心尖部，于VEGF緩釋微球移植組動(dòng)物梗死周邊區(qū)心肌注射包載VEGF的緩釋微球，每只動(dòng)物注射3點(diǎn)，每點(diǎn)注射量3mg(含VEGF3μg)；于空載微球組梗

5、死周邊區(qū)心肌注射等量未包裹VEGF的緩釋微球，每只動(dòng)物注射3個(gè)點(diǎn)。對(duì)照組注射含等量VEGF的磷酸鹽緩沖液。微球移植后24h(基線)及21d(終點(diǎn))，電影MRI和增強(qiáng)MRI采集動(dòng)物心功能參數(shù)并測(cè)量心梗面積。終點(diǎn)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)束后處死動(dòng)物進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，免疫組化法檢測(cè)微球移植局部缺血心肌的纖維化程度、毛細(xì)血管密度及微球降解情況。 結(jié)論: 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子緩釋明膠微球能夠誘導(dǎo)缺血心肌區(qū)新生血管形成。 目的: 本研究通過(guò)觀察血管內(nèi)皮

6、生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)緩釋明膠微球與自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)聯(lián)合移植于豬心肌梗死模型梗死周邊區(qū)3周后MSCs的生存情況，結(jié)合磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)，闡明改善局部微環(huán)境對(duì)自體MSCs移植于缺血心肌后轉(zhuǎn)歸的影響。 方法: 以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微球。中

7、華小型豬18頭。抽取髂骨骨髓并制備自體MSCs，以注射用順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide particles，SPIO)、4’，6—二脒基-2-苯基吲哚(4’，6—Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)標(biāo)記細(xì)胞并進(jìn)行標(biāo)記率檢測(cè)。按照隨機(jī)化表將動(dòng)物分為對(duì)照組、MSCs移植組(MSCs組)及MSCs—VEGF緩釋微球聯(lián)合移植組(MSCs—VEGF

8、組)。開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制備小型豬心肌梗死模型。模型建立后第14天，磁共振延遲增強(qiáng)成像(delated enhancement MRI，DE—MRI)檢測(cè)梗死面積后行二次開胸，直視經(jīng)心外膜于MSCs組動(dòng)物心肌梗死周邊區(qū)注射MSCs3個(gè)點(diǎn)(3×107/點(diǎn))，于MSCs—VEGF緩釋微球組每只動(dòng)物注射3個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射MSCs3×107及VEGF緩釋明膠微球3mg(含人重組VEGF1653μg)，于對(duì)照組動(dòng)物心梗周邊區(qū)相應(yīng)部位注射培養(yǎng)基

9、DMEM。微球移植后24h(基線)及21d(終點(diǎn))，電影MRI和增強(qiáng)MRI采集動(dòng)物心功能參數(shù)包括射血分?jǐn)?shù)、左室舒張末期容積、左室收縮末期容積、左室前壁室壁增厚率，并測(cè)量心梗面積。終點(diǎn)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)束后處死動(dòng)物進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，免疫組化法檢測(cè)微球移植局部缺血心肌的纖維化程度、毛細(xì)血管密度及干細(xì)胞存活情況。 結(jié)論: VEGF緩釋明膠微球可以提高移植于缺血心肌區(qū)3周MSCs的生存率。移植干細(xì)胞所生存的微環(huán)境是影響其轉(zhuǎn)歸的重要因素。

10、目的: 通過(guò)觀察移植于豬心肌梗死模型梗死周邊區(qū)及正常心肌區(qū)順磁性氧化鐵顆粒標(biāo)記的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)所形成低信號(hào)區(qū)的信號(hào)變化情況，結(jié)合組織學(xué)檢查結(jié)果，評(píng)價(jià)MRI對(duì)干細(xì)胞移植于缺血心肌后數(shù)量演變的監(jiān)測(cè)價(jià)值。 方法: 中華小型豬6頭，抽取髂骨骨髓并制備自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，以注射用順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide particles，S

11、PIO)和4’，6—二脒基-2-苯基吲哚(4’，6—Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)標(biāo)記細(xì)胞并進(jìn)行標(biāo)記率檢測(cè)。開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制備小型豬心肌梗死模型。模型建立后14d，行二次開胸，直視經(jīng)心外膜于每只動(dòng)物心肌梗死周邊區(qū)和正常心肌區(qū)各注射標(biāo)記MSCs2個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射MSCs3×107。同時(shí)分別于各區(qū)注射培養(yǎng)基2個(gè)點(diǎn)作為對(duì)照點(diǎn)。細(xì)胞移植后24h及21d，快速梯度回波序列(FG

12、RE序列)T2+像檢測(cè)干細(xì)胞移植點(diǎn)低信號(hào)區(qū)的面積及信號(hào)強(qiáng)度。T2*信號(hào)減低區(qū)范圍的測(cè)量由FGRE面積法實(shí)現(xiàn)，其信號(hào)減低的程度以正常心肌區(qū)和該區(qū)的T2*值之差與正常心肌區(qū)T2*值的百分比表示。病理組織學(xué)檢查心肌細(xì)胞形態(tài)、瘢痕形成、毛細(xì)血管密度及干細(xì)胞存活情況。不同時(shí)點(diǎn)MSCs注射點(diǎn)低信號(hào)區(qū)面積及T2*信號(hào)強(qiáng)度的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析及配對(duì)t檢驗(yàn)。干細(xì)胞注射點(diǎn)與對(duì)照點(diǎn)毛細(xì)血管密度的比較、梗死周邊區(qū)及正常心肌區(qū)MSCs注射點(diǎn)信號(hào)衰減幅度的比

13、較采用成組資料t檢驗(yàn)。 結(jié)論: MRI可在一定時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)移植干細(xì)胞的示蹤并反映移植MSCs在心肌局部的數(shù)量變化趨勢(shì)。移植干細(xì)胞所生存的微環(huán)境是影響其生存時(shí)間的重要因素。 目的: 本研究從細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的角度探討在間充質(zhì)干細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中標(biāo)記于干細(xì)胞胞漿中的超順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide，SPIO)標(biāo)記率的演變，以明確干細(xì)胞分裂增殖對(duì)SPIO標(biāo)記率變化的影響。 方法:

14、抽取豬髂骨骨髓，密度梯度離心后獲取單個(gè)核細(xì)胞層，以差時(shí)貼壁的方法純化培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。第一代細(xì)胞達(dá)到80％融合時(shí)，以1：3比例接種于兩組六孔板中。以含有10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)。在細(xì)胞達(dá)60-70％融合時(shí)，換以含鐵25ng/L及多聚賴氨酸375pg/L的培養(yǎng)基為細(xì)胞換液，并培養(yǎng)細(xì)胞48h。之后，細(xì)胞達(dá)到80％融合。將另一六孔板中的細(xì)胞以1：3比例傳代至新的3塊六孔板中，其中兩塊板的六個(gè)孔底部放置滅菌蓋玻片。其中一