骨髓增生異常綜合征患者DNA甲基化與地西他濱去甲基化療效的臨床研究.pdf

1、研究背景:
　　 骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)是一組起源于造血干細(xì)胞的異質(zhì)性克降性疾患,主要特征是骨髓衰竭,外周血細(xì)胞減少和高危演變?yōu)榧毙运柘蛋籽?acute myeloid leukemia,AML)。MDS的發(fā)病機制尚未明確,疾病的發(fā)展涉及多種因素,近年來對MDS的研究主要集中在基因突變和雜合性缺失。隨著研究的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)的改變在MDS的形成中也具有重要的作用,表觀

2、遺傳學(xué)(epigenetics)是指非基因序列改變所致基因表達(dá)水平的變化,主要包括DNA甲基化與組蛋白乙?；惓?因此對異常甲基化的研究也漸漸成為熱點。
　　 DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化下,以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上的過程。真核細(xì)胞基因組CpG序列中約60-80％的胞嘧啶是甲基化的,但這種甲基化修飾一般僅限于:(1)少數(shù)基因的5’CpG島

3、如雌性動物非活性X染色體上基因、Alu,Li序列和印記基因。(2)CpG島以外的CpG二核苷酸序列。CpG島為位于基因啟動子和/或外顯子內(nèi)富含CpG的區(qū)域,50％-60％基因的啟動子均含有CpG島,CpG島在正常細(xì)胞通常處于非甲基化狀態(tài)。異常的高度甲基化經(jīng)常發(fā)生于富于CpG島的腫瘤抑制基因啟動子區(qū),并導(dǎo)致該基因的沉默,使細(xì)胞獲得生長優(yōu)勢而異常增生,成為促進(jìn)腫痛形成的主要因素之一。近年來對表觀遺傳學(xué)在MDS中的作用主要集中于DNA甲基化與

4、轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的研究。研究顯示,腫瘤抑制基因異常甲基化與MDS的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),通過多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化,如細(xì)胞周期、凋亡等途徑。
　　 由于DNA甲基化在腫瘤形成中的重要作用以及其可逆性在臨床上為MDS的治療提供了一種新的可能。地西他濱(decitabine)為胞嘧啶類似物,能通過抑制DNMT1使抑痛基因恢復(fù)正常的去甲基化狀態(tài),重新激活那些由于DNA過度甲基化而失活的基因,使細(xì)胞恢復(fù)正常的終末分化、衰老或凋亡。研究證

5、實地西他濱有抗腫瘤活性且表現(xiàn)為劑量相關(guān)的雙重機制,高濃度時具有細(xì)胞毒作用,低濃度時具去甲基化作用。1993年Zagonel等報道小劑量地西他濱治療骨髓增生異常綜合征(MDS)有效,地西他濱治療MDS的臨床療效在隨后的臨床試驗中得到了進(jìn)一步肯定。2006年FDA已批準(zhǔn)地西他濱用于治療MDS。
　　 本論文分二部分:
　　 第一部分:骨髓增生異常綜合征患者DNA啟動子甲基化檢測與臨床特征的關(guān)系
　　 目的:檢測骨髓增

6、生異常綜合征(MDS)患者DNA啟動子甲基化水平,探討其與臨床特征的關(guān)系。
　　 方法:以β-actin為內(nèi)參照,用熒光定量PCR的方法檢測MDS患者骨髓及外周血P15、CDH1、DAPK、HIC1基因甲基化水平,分析其與患者年齡,性別,IPSS分型,原始細(xì)胞,白細(xì)胞計數(shù),血紅蛋白,血小板計數(shù)的關(guān)系。
　　 結(jié)果:分別檢測18例初診患者的骨髓及外周血樣本的四個基因甲基化水平,發(fā)現(xiàn)兩種樣本中各基因甲基化水平無明顯差異；檢測

7、70例樣本(骨髓及外周血細(xì)胞)四個基因甲基化水平,結(jié)果示:高危(RAEB Ⅰ/Ⅱ)MDS患者P15及CDH1的甲基化水平較低危(RCUD/RARS/5q-和RCMD)MDS患者、對照組顯著升高,P值均<0.001；各分型之間DAPK基因甲基化水平均無統(tǒng)計學(xué)差異；而HIC1基因甲基化水平僅在RAEB Ⅰ/Ⅱ與對照組中有顯著差異,P=0.007。進(jìn)行偏相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)P15基因甲基化水平與IPSS分型(P<0.001),原始細(xì)胞％(P=0.00

8、4),血小板計數(shù)有顯著相關(guān)關(guān)系(P=0.031,),相關(guān)系數(shù)分別為0.484,0.389,-0.30; CDH1基因甲基化水平與IPSS分型(P=0.001),原始細(xì)胞％(P=0.009),有顯著相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)0.456,0.360；DAPK基因甲基化水平僅與年齡有顯著相關(guān)關(guān)系(P=0.042),相關(guān)系數(shù)0.283；HIC1基因甲基化水平與各項均無顯著相關(guān)性。
　　 結(jié)論:
　　 1.P15,CDH1基因作為MDS中

9、較特征性出現(xiàn)的高度甲基化的基因,其甲基化水平與原始細(xì)胞,IPSS危險度分型密切相關(guān),提示P15及CDH1基因啟動子甲基化致其失活與MDS的疾病進(jìn)展,預(yù)后有重要關(guān)系。
　　 2.DAPK基因雖然在各分型中均能檢測到甲基化,但是水平很低,各分型之間無顯著差異,本研究發(fā)現(xiàn)DAPK的甲基化水平僅與年齡有關(guān)。
　　 3.本研究中雖然HIC1甲基化水平從低危組(RCUD/RARS/5q-和RCMD)至高危組(RAEB Ⅰ/Ⅱ)有升高

10、趨勢,但是其甲基化水平與原始細(xì)胞,IPSS分型等無關(guān),其意義還有待于進(jìn)一步研究。
　　 第二部分:地西他濱治療后骨髓增生異常綜合征患者的甲基化變化
　　 目的:連續(xù)檢測MDS患者使用地西他濱治療后DNA甲基化水平的變化,了解其變化規(guī)律。
　　 方法:7例患者接受規(guī)律的地西他濱治療,均為RAEB Ⅰ/Ⅱ型,分兩組:3天方案,15mg/m2 ⅳ.q8h×3d,6周/療程；5天方案,20mg/m2 ⅳ.qd×5d,4周

11、/療程?；颊哂盟幤陂g,5天方案和3天方案分4/6個時間點采其外周血:用藥第0/1天(W1),用藥第5/7天(W2),用藥第15天(W3),用藥第22天(W4),3天方案加第29天(W5)及第36天(W6)。根據(jù)第一部分介紹的方法提取DNA,處理后檢測其甲基化水平變化,并分析兩組間的去甲基化水平有無差異。結(jié)果:用藥前3位患者(002,5天方案；004,007,3天方案)P15甲基化水平較高,20％-65％,CDH1水平相似,均較低,0.5

12、％-5％。無論5天方案還是3天方案,用藥前甲基化水平越高,用藥后下降越明顯,患者用藥第5/7天后P15、CDH1甲基化水平下降幅度最大,達(dá)20％-60％,P15可維持在下降后的水平,在隨后的治療中未再出現(xiàn)明顯的下降,但是CDH1的波動較大,用藥期間CDH1甲基化水平可升至≥用藥前水平。目前的數(shù)據(jù)表明甲基化的變化與血象變化不一致,骨髓抑制期一般出現(xiàn)在每療程的第2至3周,雖然ANC較低,但是在某些患者中甲基化水平會出現(xiàn)暫時性的升高;而應(yīng)用G

13、-CSF后,ANC顯著升高,但是甲基化水平卻沒有相應(yīng)的升高。血小板的變化與ANC相似,血紅蛋白在治療期間變化較小。應(yīng)用重復(fù)測量方法分析5天方案與3天方案兩個基因甲基化水平變化,兩個不同方案去甲基化水平無顯著性差異,P值均>0.05;有血液學(xué)改善的患者與未改善患者的去甲基化程度無顯著差異,P值均>0.05。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究連續(xù)檢測了地西他濱治療后MDS患者的P15及CDH1兩個基因的甲基化水平變化,發(fā)現(xiàn)患者

14、用藥第5/7天后P15、CDH1甲基化水平下降幅度最大,在隨后的治療中P15可維持在下降后的水平,未再出現(xiàn)明顯的下降,但是CDH1的波動較大,用藥期間CDH1甲基化水平可升至≥用藥前水平。
　　 2.MDS患者用藥后,ANC及血小板于每療程的第2至3周降至最低,但是基因的甲基化水平并未隨之下降,在某些患者中甲基化水平反而會出現(xiàn)暫時性的升高,本研究結(jié)果表明:用藥期間甲基化水平的變化與血象變化并不一致。
　　 3.應(yīng)用重復(fù)測