缺氧對(duì)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響.pdf

1、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPS），具有和胚胎干細(xì)胞類似的發(fā)育多潛能性，由于其避開(kāi)了胚胎干細(xì)胞研究面臨的倫理和法律等問(wèn)題，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前有關(guān)缺氧/低氧對(duì)iPS細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響尚不清楚。iPS對(duì)腎缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)有否治療作用，目前尚無(wú)報(bào)道。
　　目的：本工作擬在iPS細(xì)胞，研究缺氧對(duì)iPS細(xì)胞的增值、遷移、黏附、凋亡以及基因表達(dá)等的影響；進(jìn)而用

2、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）siRNA轉(zhuǎn)染 iPS細(xì)胞，觀察降低HIF-1α表達(dá)后，缺氧對(duì)iPS細(xì)胞作用的影響；建立小鼠急性腎缺血模型，觀察iPS細(xì)胞是否對(duì)腎缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。
　　方法：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體向原代培養(yǎng)的MEF細(xì)胞導(dǎo)入Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc四種基因，誘導(dǎo)出iPS細(xì)胞。iPS細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為四組：①常氧（Normoxia）組、②缺氧（Hypoxia）組、③缺氧+轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列siRNA（Hyp

3、oxia+con siRNA）組、④缺氧+轉(zhuǎn)染HIF-1a siRNA（Hypoxia+HIF-1a siRNA）組，向③④組iPS細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染con siRNA和HIF-1a siRNA，然后將②③④同時(shí)置缺氧盒里缺氧處理12小時(shí)，應(yīng)用real-time PCR、流式細(xì)胞儀等技術(shù)檢測(cè)各組iPS細(xì)胞的基因表達(dá)、凋亡、增殖、遷移、粘附等情況。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立腎缺血再灌注模型，采用摘除右腎，左腎動(dòng)靜脈扎閉50分鐘的方法，分別向各組左腎包膜內(nèi)注

4、射以下不同處理過(guò)的iPS細(xì)胞:常氧iPS細(xì)胞、低氧處理iPS細(xì)胞、低氧+con siRNA iPS細(xì)胞、低氧+HIF-1a siRNA iPS細(xì)胞和PBS，觀察上述iPS細(xì)胞干預(yù)對(duì)腎缺血再灌注損傷的影響。
　　結(jié)果：1缺氧及HIF-1a對(duì) iPS細(xì)胞增殖的影響：與常氧組（1±0）相比，Hypoxia組（0.86±0.04）iPS細(xì)胞數(shù)明顯下降，下降至缺氧前的86±4％，P<0.05；與陰性對(duì)照Hypoxia+con siRNA組(

5、0.87±0.03)相比，Hypoxia+HIF-1 a siRNA組(0.77±0.02)iPS細(xì)胞數(shù)明顯下降，P<0.05。以上結(jié)果表明缺氧可抑制iPS細(xì)胞增殖，降低HIF-1 a表達(dá)加重缺氧對(duì)iPS細(xì)胞增殖的抑制作用。2缺氧及HIF-1a對(duì)iPS細(xì)胞遷移的影響：與常氧組（1±0）相比，Hypoxia組遷移細(xì)胞數(shù)比常氧組明顯增多,為3.96±0.84,P<0.05；Hypoxia+HIF-1 a siRNA組為1.22±0.04,比

6、Hypoxia+con siRNA組（4.12±1.11）明顯減少，P<0.05,表明缺氧促進(jìn)iPS細(xì)胞遷移，降低HIF-1 a表達(dá)可抑制缺氧對(duì)iPS細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。3缺氧及HIF-1a對(duì) iPS細(xì)胞穿內(nèi)皮遷移的影響：與常氧組1±0相比， Hypoxia組穿內(nèi)皮遷移的iPS細(xì)胞數(shù)明顯減少，為0.56±0.10，P<0.05；與Hypoxia+con siRNA（0.70±0.19）相比，Hypoxia+HIF-1 a siRNA組上

7、升為1.19±0.19，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；表明缺氧抑制iPS細(xì)胞穿內(nèi)皮遷移，降低HIF-1 a表達(dá)可抑制缺氧對(duì)iPS細(xì)胞穿內(nèi)皮遷移的作用。4缺氧及HIF-1a對(duì)iPS細(xì)胞黏附的影響：常氧組為1±0，與其相比Hypoxia組降低為0.60±0.09，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Hypoxia+con siRNA組為0.75±0.10，與其相比Hypoxia+HIF-1 a siRNA組上升為1.41±0.15，P<0.05，有統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)差異；說(shuō)明缺氧抑制iPS細(xì)胞粘附，降低HIF-1 a表達(dá)可減弱缺氧抑制iPS細(xì)胞的粘附作用。5缺氧及HIF-1a對(duì)iPS細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響：常氧組iPS細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理為1±0，Hypoxia組為0.73±0.10，與常氧組相比Hypoxia組明顯下降，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Hypoxia+con siRNA組為0.82±0.08，與其相比Hypoxia+HIF-1 a siRNA組上升為1.20±0.16

9、，P<0.05；以上結(jié)果表明，缺氧抑制iPS細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，降低HIF-1 a表達(dá)可減弱缺氧抑制iPS粘附的作用。6缺氧及HIF-1a對(duì)iPS細(xì)胞凋亡的影響：常氧組早期凋亡為11.28±1.34，與常氧組相比Hypoxia組上升為14.23±2.98，P≥0.05，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Hypoxia+con siRNA組為19.95±4.22，與其相比，Hypoxia+HIF-1 a siRNA組降低為16.22±1.44，P≥0.0

10、5，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。常氧組晚期凋亡為5.35±1.09，Hypoxia組上升為6.63±0.14，與常氧組相比P≥0.05，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Hypoxia+con siRNA組為16.18±1.19，與其相比，Hypoxia+HIF-1 a siRNA組降低為14.26±0.62，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明缺氧對(duì)iPS細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡沒(méi)有顯著作用；但降低HIF-1 a，可在一定程度上抑制晚期凋亡。7缺氧處理iPS細(xì)胞

11、12小時(shí)，SOD1、FGFR2、CCS、TEK、PLAU、NME4、MTA2基因的RNA表達(dá)明顯下降，降低iPS細(xì)胞HIF-1a表達(dá)可抑制缺氧對(duì)iPS細(xì)胞上述基因的作用。8缺氧及HIF-1a對(duì)iPS細(xì)胞在缺血再灌腎臟中遷移的影響：與正常iPS組（1±0）相比， Hypoxia組（1.56±0.33）iPS細(xì)胞在損傷腎臟中遷移距離明顯增長(zhǎng)，且P<0.05；與Hypoxia+con siRNA組（1.37±0.21）相比 Hypoxia+H

12、IF-1a siRNA組（0.6±0.21）iPS細(xì)胞在缺血再灌注腎臟中的遷移距離明顯縮短，且P<0.05，這與上文中iPS細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。9 iPS細(xì)胞對(duì)缺血再灌注損傷腎臟腎功能的影響：與PBS組（134.95±16.75）相比，正常iPS組（216.66±27.87）小鼠血清肌苷升高；與正常iPS組（216.66±27.87）相比，Hypoxia組血清肌苷下降明顯，為40.21±40.58，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；

13、與Hypoxia+con siRNA組（112.64±29.81）相比，Hypoxia+HIF-1 a siRNA組血清肌苷值有明顯上升，為153.71±25.26。以上結(jié)果表明：腎包膜下注射缺氧處理的iPS細(xì)胞，可降低缺血再灌注損傷腎臟小鼠的血清肌苷值；降低缺氧iPS細(xì)胞HIF-1 a表達(dá)可抑制缺氧iPS細(xì)胞降低肌苷值的作用。
　　結(jié)論：1．缺氧處理12小時(shí)可抑制iPS細(xì)胞增殖；降低iPS細(xì)胞HIF-1a表達(dá)可加重缺氧對(duì)iPS細(xì)

14、胞增殖的抑制作用。2．缺氧處理12小時(shí)可促進(jìn)iPS細(xì)胞遷移；降低HIF-1a表達(dá)，可明顯抑制缺氧促進(jìn)iPS細(xì)胞遷移的作用。3．iPS細(xì)胞可自由穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞；缺氧處理可明顯抑制iPS細(xì)胞穿內(nèi)皮細(xì)胞遷移；降低HIF-1a表達(dá)又會(huì)逆轉(zhuǎn)缺氧抑制遷移的現(xiàn)象，促進(jìn)iPS細(xì)胞穿內(nèi)皮遷移。4．缺氧處理12小時(shí)，對(duì)iPS細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡沒(méi)有顯著作用；但轉(zhuǎn)染HIF-1a siRNA降低缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)后，可在一定程度上抑制晚期凋亡。5．缺氧處理iPS

15、細(xì)胞明顯抑制iPS細(xì)胞與iPS細(xì)胞黏附以及iPS細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，降低缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)能逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。6.缺氧處理可抑制iPS細(xì)胞SOD1、FGFR2、CCS、TEK、PLAU、NME4、MTA2等基因的RNA表達(dá)，降低iPS細(xì)胞HIF-1a表達(dá)能抑制缺氧對(duì)iPS細(xì)胞上述基因表達(dá)的影響。7.缺氧處理能促進(jìn)iPS細(xì)胞在小鼠缺血腎臟中的遷移，降低HIF-1a表達(dá)后，iPS細(xì)胞遷移距離相對(duì)縮短。8.腎包膜下給予缺氧處理過(guò)的iPS細(xì)胞，與PB