弓形蟲(chóng)感染與HeLa細(xì)胞凋亡的初步研究.pdf

1、目的:
　　以剛地弓形蟲(chóng)RH株速殖子感染HeLa細(xì)胞，研究弓形蟲(chóng)感染調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的能力，探討弓形蟲(chóng)致密顆?？乖?(GRA1)的分泌與宿主細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　方法:
　　24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)接種HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)16h后各孔接種不同數(shù)量(MOI分別為0.1、1、5和10)弓形蟲(chóng)速殖子，4h后在培養(yǎng)液中加入終濃度為0.5μg/ml放線菌素D(ActD)誘導(dǎo)凋亡，于加藥后8h、12h、24h和36h收集細(xì)胞，通過(guò)Hoec

2、hst33258染色法和AnnexinV-FITC/PI法檢測(cè)HeLa細(xì)胞凋亡率。
　　根據(jù)ToxoDB基因庫(kù)中GRA1基因序列，DNAstar軟件設(shè)計(jì)并合成1對(duì)特異性引物。以弓形蟲(chóng)cDNA為模板，PCR擴(kuò)增GRA1基因。構(gòu)建重組質(zhì)粒GRA1/pTG19-T和GRA1/pET-32a，在大腸埃希菌Rosetta(DE3)菌株中誘導(dǎo)表達(dá)。Ni-NTA親合層析柱純化重組GRA1蛋白并制備其兔多克隆抗體，Western blotting

3、技術(shù)鑒定此多克隆抗體。
　　24孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)分別接種HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)16h后各孔按MOI=10比例接種弓形蟲(chóng)速殖子。感染后0～60 min(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)和1～36h(1 h、4h、8h、12h、24 h、36 h)，以Hoechst33258染色和Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)HeLa細(xì)胞凋亡率，采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)

4、GRA1表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　弓形蟲(chóng)感染HeLa細(xì)胞8h時(shí)，各感染組細(xì)胞凋亡率與ActD誘導(dǎo)對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。感染12h時(shí)，MOI=0.1組和MOI=1組HeLa細(xì)胞凋亡率明顯低于ActD誘導(dǎo)對(duì)照組(P＜0.05)，但隨著蟲(chóng)體數(shù)量增加，HeLa細(xì)胞凋亡率顯著增高，MOI=5組和MOI=10組細(xì)胞凋亡率明顯高于ActD誘導(dǎo)對(duì)照組(P＜0.05);感染24h時(shí)，MOI=0.1組細(xì)胞凋亡率高于ActD誘導(dǎo)對(duì)照組，

5、但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而MOI=1組、MOI=5組和MOI=10組細(xì)胞凋亡率明顯高于ActD誘導(dǎo)對(duì)照組(P＜0.05);感染36h時(shí)，各感染組細(xì)胞凋亡率明顯低于ActD誘導(dǎo)對(duì)照組(P＜0.05)。
　　成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒GRA1/pET-32a，并在Rosetta(DE3)菌株中大量表達(dá)，并獲得效價(jià)較高的多克隆抗體。Western blotting結(jié)果表明，24 kDa處有一條明顯的蛋白表達(dá)條帶，與理論值大小一致。

6、
　　弓形蟲(chóng)感染HeLa細(xì)胞60 min內(nèi)，HeLa細(xì)胞凋亡率先降低(0～30min)再升高(30～60min);感染后1～36 h，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，HeLa細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。在弓形蟲(chóng)感染后0～60 min，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，弓形蟲(chóng)分泌GRA1逐漸增多;弓形蟲(chóng)感染后1～36 h，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，蟲(chóng)體分泌GRA1逐漸減少。
　　結(jié)論:
　　當(dāng)MOI≤1時(shí)，弓形蟲(chóng)感染表現(xiàn)為抑制ActD誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡.隨著蟲(chóng)體數(shù)