上調(diào)腎小管SnoN蛋白表達(dá)改善糖尿病腎病腎纖維化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：腎小管間質(zhì)纖維化(renal tubulointerstitial fibrosis，RTIF)是糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN)的主要病理特征，在RTIF進(jìn)程中腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但此過(guò)程涉及多種分子介質(zhì)和細(xì)胞事件的參與，影響因素眾多，且相互作用復(fù)雜，以致至今對(duì)其分子機(jī)制尚未完全闡明。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子

2、-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前公認(rèn)致纖維化作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，主要通過(guò)TGF-β1/Smad細(xì)胞信號(hào)通路誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)腎小管EMT及RTIF的全過(guò)程。核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN(Ski-related novel protein N)是該信號(hào)傳導(dǎo)途徑的重要負(fù)調(diào)控因子，對(duì)TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)起負(fù)調(diào)控作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在DN發(fā)病過(guò)程中SnoN蛋白的減少放大了TGF-β1的致纖

3、維化效應(yīng)，但SnoN蛋白表達(dá)降低在DN腎纖維化發(fā)病中的確切作用和機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)旨在以SnoN為研究靶點(diǎn)，以糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）大鼠模型和高糖處理的腎小管上皮細(xì)胞（renal tubular epithelial cells，RTECs）為研究對(duì)象，分別從蛋白水平、轉(zhuǎn)錄水平、外源性藥物干預(yù)等三個(gè)方面，利用siRNA技術(shù)敲低RTECs中E3泛素連接酶Arkadia表達(dá)、慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體系使RTE

4、Cs過(guò)表達(dá)SnoN、體內(nèi)和體外OM干預(yù)等方法，結(jié)合腎小管EMT和纖維化等相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。進(jìn)一步明確SnoN表達(dá)變化與腎小管EMT和RTIF的關(guān)系，探討上調(diào)腎小管SnoN表達(dá)在改善DN腎間質(zhì)纖維化發(fā)病中的作用及其可能機(jī)制，為有效防治DN提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1.（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照（NC）組和DM組。以尾靜脈注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）復(fù)制DM大鼠模型，48小時(shí)（h）后測(cè)空

5、腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖陽(yáng)性者判斷造模成功。NC組大鼠尾靜脈注射STZ溶媒。各組大鼠均予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)至16周（W）處死。生化法測(cè)血糖（BG）、血肌酐（Scr）、尿蛋白（UP），記錄24h尿量計(jì)算24h尿蛋白量（24hUP）；HE（hematoxylin and eosin）和Masson染色后顯微鏡下觀察腎組織病理變化；免疫組化法檢測(cè)E-鈣粘素（E-cadherin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smoot

6、h muscle actin，α-SMA）和纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）在腎小管的分布和表達(dá)；Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time fluorescent quantitative Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）分別檢測(cè)TGF-β1、SnoN、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表達(dá)。（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)的正常大

7、鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)隨機(jī)分組，①正常糖（NG）組：2％ FBS+ DMEM+5.5mmol/L Glucose，②高糖(HG)組：2% FBS+ DMEM+25mmol/L Glucose，各組分別設(shè)2h、12h、24h、48h和72h五個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)；應(yīng)用免疫熒光染色（Immunofluorescence staining，IF）檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA表達(dá)變化，Western blot和qRT-

8、PCR分別檢測(cè)各組細(xì)胞中TGF-β1、SnoN、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表達(dá)。2.采用siRNA干擾技術(shù)敲低正常人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中Arkadia的表達(dá)，高糖條件下培養(yǎng)48h后，qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞SnoN和Arkadia的mRNA表達(dá)；Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞SnoN、Arkadia、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA等的蛋白表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸

9、附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)液中的FN蛋白量。3.利用慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體系使HK-2細(xì)胞中SnoN過(guò)表達(dá)，高糖條件下培養(yǎng)48h后，Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞SnoN、Arkadia、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA等的蛋白表達(dá)；qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞SnoN和Arkadia的mRNA表達(dá)；ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中的FN蛋白量。4. OM干預(yù)

10、處理，（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：雄性SD大鼠隨機(jī)分為NC組、DM組和OM治療組。STZ復(fù)制DM大鼠模型，48h后測(cè)空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖陽(yáng)性者判斷造模成功。NC組大鼠尾靜脈注射STZ溶媒，OM治療組自DM大鼠造模成功次日起，予以75mg//kg/d OM灌胃處理。各組大鼠均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，大鼠飼養(yǎng)至16 W處死。生化法測(cè)BG、Scr、UP，記錄24 h尿量計(jì)算24hUP；HE和Masson染色后顯微鏡下觀察腎組織

11、病理變化；免疫組化法檢測(cè)E-cadherin、α-SMA、FN在腎小管的分布和表達(dá)；Western blot和qRT-PCR分別檢測(cè)TGF-β1、SnoN、Smad7、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表達(dá)。（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一：NRK52E細(xì)胞分組①NG組，②HG組，③HG+不同濃度OM（0.01、0.05、0.10、0.25、0.50mg/ml）組，培養(yǎng)48h。利用免疫熒光染色-激光共聚焦顯微鏡（IF

12、-LSCM）檢測(cè)E-cadherin和α-SMA的表達(dá)強(qiáng)度、Western blot、qRT-PCR方法檢測(cè)SnoN、Smad7、TGF-β1、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)二：①NG組，②HG組，③HG+0.50mg/ml OM動(dòng)態(tài)觀察(HM)組，分別設(shè)2h、12h、24h、48h和72h五個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，利用Western blot、qRT-PCR方法檢測(cè)SnoN、Sm

13、ad7、TGF-β1、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN蛋白和mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：1.（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：與NC組相比，DM組大鼠BG、Scr、24hUP顯著增高，伴明顯腎纖維化病變，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，α-SMA、FN蛋白表達(dá)顯著增高；TGF-β1、Arkadia蛋白和mRNA表達(dá)顯著增高；SnoN蛋白水平顯著降低，而mRNA水平顯著增高。（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：與NG組相比，HG組NRK52E細(xì)

14、胞隨高糖刺激時(shí)間延長(zhǎng)，TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN蛋白和mRNA表達(dá)進(jìn)行性增高，E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行性降低，呈時(shí)間依賴性；SnoN蛋白表達(dá)進(jìn)行性降低，而SnoN mRNA表達(dá)進(jìn)行性增高。2. siRNA敲低正常人近端腎小管細(xì)胞（HK-2）的Arkadia后高糖處理48h，與空白細(xì)胞組相比，Arkadia mRNA和蛋白水平顯著降低，SnoN和E-cadherin表達(dá)顯著增高，α-SMA和FN表達(dá)

15、顯著降低，TGF-β1表達(dá)無(wú)顯著差異。3.過(guò)表達(dá)SnoN的HK-2細(xì)胞高糖處理48h后，與空白細(xì)胞組相比，SnoN mRNA和蛋白水平均顯著增高，E-cadherin表達(dá)顯著增高，α-SMA和FN蛋白顯著降低，Arkadia和TGF-β1表達(dá)均無(wú)顯著差異。4. OM干預(yù)效果（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：與DM組相比，OM治療組BG無(wú)明顯差異，Scr、24hUP明顯降低，纖維化病變有所改善，TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN表達(dá)明顯降低，S

16、noN、Smad7、E-cadherin表達(dá)明顯增高。（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一：①激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，作用48h，與NG組相比，HG組E-cadherin表達(dá)明顯減弱，α-SMA表達(dá)明顯增強(qiáng)；與HG組相比，HG+OM不同濃度組隨OM劑量下降，E-cadherin表達(dá)逐漸減弱，α-SMA表達(dá)逐漸增強(qiáng)；與HG組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)NRE52E細(xì)胞相比，HG+0.50mg/ml OM組TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN mRNA和蛋白顯著降

17、低，Smad7和SnoN蛋白顯著增高，E-cadherin mRNA和蛋白顯著增高，而Smad7和SnoN mRNA水平無(wú)明顯差異。②Western blot、qRT-PCR結(jié)果顯示，與HG組相比，HG+OM不同濃度組隨OM劑量增加，TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN蛋白和mRNA表達(dá)均逐漸降低，E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)逐漸增高，SnoN和Smad7蛋白表達(dá)逐漸增高，呈劑量依賴性，而SnoN和Smad7 mRN

18、A表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：1.高糖通過(guò)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞中Arkadia表達(dá)增高，增強(qiáng)對(duì)SnoN蛋白泛素化降解水平而下調(diào)SnoN蛋白表達(dá)，即腎小管上皮細(xì)胞中SnoN的表達(dá)受Arkadia調(diào)控；2.敲低腎小管上皮細(xì)胞中Arkadia mRNA表達(dá)，使SnoN蛋白表達(dá)上調(diào)，對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管EMT有抑制作用；3.過(guò)表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞中SnoN可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管EMT；4. OM通過(guò)抑制Arkadia表達(dá)而上調(diào)SnoN蛋白表達(dá)，