上皮性腫瘤細胞表達Ig alpha重鏈及其生物學功能的研究.pdf

1、前期工作從中國人鼻咽癌細胞株CNE2的基因組DNA文庫中克隆了一個具有細胞惡性轉化功能的基因Tx。通過序列分析發(fā)現Tx基因是一個缺乏可變區(qū)(V區(qū))的Ig kappa輕鏈基因。進一步的EST數據庫分析提示，上皮性腫瘤細胞可能表達Ig kappa輕鏈。通過一系列分子生物學實驗證實了上皮性腫瘤細胞表達Ig kappa輕鏈的轉錄本和蛋白質。 在上皮性腫瘤細胞表達Ig kappa輕鏈這一原創(chuàng)性發(fā)現的基礎上，發(fā)現腫瘤組織中也存在Ig alp

2、ha重鏈蛋白的陽性信號。這使繼Ig kappa輕鏈的研究之后，進一步對Ig alpha重鏈在上皮性腫瘤細胞中表達的現象和功能等進行深入而系統(tǒng)的研究，旨在為認識上皮性腫瘤細胞表達Ig這一異常現象及其潛在的生物學意義提供重要的理論依據。 1．利用生物信息學分析和預測Ig alpha重鏈在多種腫瘤組織中的表達 EST數據庫常被用于鑒定某一基因在哪些組織或細胞中表達。因此，首先將Ig alpha重鏈恒定區(qū)(C區(qū))基因進行了EST

3、的搜索分析，發(fā)現大部分EST來源于B淋巴細胞，但有部分EST來源于肺癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、腎癌、宮頸癌等上皮性腫瘤組織或細胞。 進一步，通過Virtual Northern Blot分析了Ig alpha重鏈的表達譜，結果表明Ig alpha重鏈表達于B淋巴細胞、肺癌、腎癌、前列腺癌、宮頸癌、結腸癌、軟骨肉瘤、卵巢癌、鱗狀細胞癌等一系列上皮性腫瘤組織或細胞中。這現癌細胞表達Ig alpha 重鏈這一現象提了有力的佐證。

4、 2．確定上皮性腫瘤細胞系和組織表達Ig alpha重鏈 生物信息學的分析提供了初步的證據。進一步，通過一系列實驗方法來證實上皮性腫瘤細胞能夠表達Ig alpha重鏈?？紤]到Ig V，D，J區(qū)基因片段眾多，重組后的VDJ基因序列變異性較大，因此，首先分析了Ig保守的恒定區(qū)C區(qū)的表達。利用SW480(人結腸腺癌細胞系)、MCF-7(人乳腺腺癌細胞系)、HeLa(人宮頸低分化鱗狀上皮癌)、MGC(人胃癌細胞系)、CNEl(人鼻咽癌

5、細胞系)五種上皮性腫瘤細胞系，通過RT-PCR擴增Ig alpha重鏈恒定區(qū)(Cα區(qū))，并通過測序，結果證實了多種上皮性腫瘤細胞系中存在Ig alpha 重鏈CαmRNA基因的表達。 進一步，采用質譜分析從氨基酸水平證實Ig alpha蛋白在腫瘤細胞中的表達。將CNEl全蛋白通過SDS-PAGE膠分離，切下50-60KD蛋白質分子量范圍的膠條，利用質譜分析蛋白的氨基酸序列。質譜結果匹配到20種不同的蛋白，其中包含anti-col

6、orectal carcinoma Ig heavy chain protein,其匹配的氨基酸序列位于Ig重鏈V區(qū)。雖然沒有獲得Ig重鏈Cα區(qū)的直接信息，但Ig重鏈V區(qū)的信息仍然Ig重鏈蛋白。 3.上皮性腫瘤細胞分泌Ig alpha重鏈蛋白 進一步,通過無血清培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng),利用雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清中的Ig alpha蛋白,結果發(fā)現所有五種上皮性腫瘤細胞的無血清培養(yǎng)上清中均存在分泌的Ig alpha重

7、鏈蛋白。同時,收集HeLa細胞系無血清培養(yǎng)上清,通過Antibody分離純化試劑盒分離并純化Ig蛋白。將獲得的Ig蛋白通過SDS-PAGE膠電泳分離,麗春紅染色。結果顯示兩個條帶,一條約56KD,另一條約25KD。進一步,通過Western Blotting分析這兩個條帶,證實一條含Ig alpha重鏈蛋白,另一條含Ig kappa輕鏈蛋白。從而確證了上皮性腫瘤細胞將Ig alpha重鏈蛋白和Ig kaooa輕鏈蛋白以結合體的形式分泌到

8、細胞外。 上述研究證實了lg alpha重鏈蛋白能被上皮性腫瘤細胞分泌出來,而且不同上皮來源的腫瘤細胞表達不同的Ig CDR3序列,且這些序列是B細胞中暫未發(fā)現的新序列,因此提示我們這種新的Ig分子有可能為上皮性腫瘤的血清學診斷提供一新的檢測指標。 4.上皮性腫瘤細胞表達Ig alpha重鏈的基因結構基礎及重要的調控分子 B淋巴細胞表達Ig重鏈時,Ig重鏈gDNA首先必須發(fā)生基因結構變化,即Ig V,D,J基因片

9、段進行重組形成VDJ連接,重組后的Ig重鏈才可能進行轉錄和翻譯。因此,分析了上皮性腫瘤細胞中Ig重鏈的gDNA基因結構。以CNE1細胞作為代表,選擇V區(qū)和J區(qū)相對保守的三對conventional primers,通過nest-PCR對CNEl gDNA的Ig VDJ基因片段進行PCR擴增,并通過測序,證實了CNEI細胞中Ig gDNA的V,D,J基因片段已經發(fā)生了重組。因此,認為上皮性腫瘤細胞中Ig gDNA基因已經形成了VDJ重組結

10、構。 通過研究上皮性腫瘤細胞表達Ig alpha重鏈的基因結構基礎，發(fā)現上皮性腫瘤細胞中同樣發(fā)生了Ig VDJ的基因重組。然而，與B細胞不同的是，上皮性腫瘤細胞表達Ig alpha重鏈并不需要進行CSR?？梢姡掀ば阅[瘤細胞表達Igalpha重鏈的機制與B細胞不完全相同。 5．上皮性腫瘤細胞表達Ig alpha重鏈及其它Ig重鏈的腫瘤生物學意義 在分析了上皮性腫瘤細胞表達并分泌Ig alpha重鏈及其重要的調控分

11、子之后，進一步對其生物學功能進行了研究。 首先通過shRNA Kit，以HeLa細胞為材料，篩選出穩(wěn)定轉染Ig alphashRNA(通過與Ig Cα區(qū)結合抑制Ig alpha的表達)的細胞系C αI，以及穩(wěn)定轉染Ig H shRNA(通過與Ig J區(qū)結合抑制所有Ig重鏈的表達)的細胞系JI。通過RT-PCR證實了與原HeLa細胞相比，C α I細胞系中Ig alpha轉錄本的表達量非常低，而JI細胞系中Ig VDJ mRNA量

12、也幾乎無法檢測出。 以此為材料，通過生長曲線分析，發(fā)現抑制上皮性腫瘤細胞表達Igalpha．重鏈對腫瘤細胞的生長無顯著影響；而抑制上皮性腫瘤細胞表達的整個工g重鏈對腫瘤細胞的生長存在較小的抑制作用。因此，認為上皮性腫瘤細胞表達的Ig alpha及其他Ig蛋白對上皮性腫瘤細胞的生長促進作用較小。通過平板集落實驗，發(fā)現抑制上皮性腫瘤細胞表達的Ig alpha重鏈對腫瘤細胞的增殖能力無顯著影響；而抑制上皮性腫瘤細胞表達的整個Ig重鏈對

13、腫瘤細胞的增殖能力有一定的抑制作用。因此，認為上皮性腫瘤細胞表達的Igal pha對上皮性腫瘤細胞的增殖能力促進作用較?。欢縄g蛋白對上皮性腫瘤細胞的增殖能力有一定的促進作用。 6．上皮性腫瘤細胞表達Ig alpha重鏈及其它Ig重鏈的免疫學功能 進一步，對上皮性腫瘤細胞表達Ig的免疫學功能進行了探討。Ig的一個重要免疫學功能是介導ADCC效應。根據前期研究結果提供的一些線索推測：癌細胞來源的Ig alpha重鏈其F

14、c段可以和單核／巨噬細胞、NK細胞表面的FcaR結合，而其Fab段由于不能和腫瘤細胞本身結合，從而不能有效介導ADCC殺傷效應。因此，這種癌細胞分泌的Ig競爭性抑制了效應Ig介導的ADCC作用，從而可能使癌細胞得到了保護。發(fā)揮ADCC效應的除了Ig alpha重鏈外，主要的是IgG分子，所以將研究拓展到全部癌Ig蛋白(包括IgA，IgG等)。 在此基礎上，進一步分析癌細胞來源的Ig競爭性抑制效應Ig介導的ADCC作用。由于mou

15、se anti-human EGFR IgG2a的Fc段與人IgGl，IgG3的Fc段具有高度同源性，能夠與人單核／巨噬細胞、NK細胞的FcR高度親和，并且HeLa細胞表面表達EGFR蛋白，所以首先利用mouse anti-hLlman EGFR IgG2a建立人單核／巨噬細胞、NK細胞殺傷HeLa細胞的ADCC效應系統(tǒng)。然后，利用CytoTox96 Non-RadiOaCtive Cytotoxicity Assay Kit，分析癌來

16、源的Ig蛋白競爭性抑制moLlse ant i-human EGFR IgG2a介導的ADCC殺傷效應。結果10μg／mlCa-IgG幾乎完全抑制了molise anti-human EGFR IgG2a(1μg／m1)介導的ADCC效應。因此，認為ca-Ig可能通過其Fc段,競爭性與殺傷細胞表面的Fcr結合,從而封閉了殺傷細胞表面的FcR，抑制了效應Ig分子介導的ADCC殺傷腫瘤細胞腫瘤免疫效應中，細胞免疫是很重要的方面。通過對上皮性

17、腫瘤細胞分泌Ig分子的免疫學功能的研究，發(fā)現癌細胞來源的Ig能抑制效應Ig分子介導的ADCC殺傷腫瘤細胞的作用。這一發(fā)現為腫瘤細胞逃避機體細胞免疫提供了一個新的機制。同時將可能從免疫調控的角度為多種上皮性腫瘤的治療提供潛在的分子靶。 通過本課題的研究，對上皮性腫瘤細胞表達免疫球蛋白這一現象有了新的科學發(fā)現，并為闡明腫瘤細胞表達Ig的病理生理學意義提供了有意義的實驗依據。這將從一個新的層面為了解腫瘤這一復雜性狀疾病提供新的啟示，