短時間低氧處理對創(chuàng)面愈合的影響及其機制研究.pdf

1、研究背景及目的意義:
　　皮膚在機體穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著重要作用,它可使機體免受物理性、化學性、機械性以及病原微生物的侵襲,還可以幫助機體的內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定。嚴重燒傷后,皮膚的完整性遭到破壞,屏障作用喪失,且極易感染。感染后的創(chuàng)面會成為機體全身感染的重要來源。燒傷創(chuàng)面的治療情況可在極大程度上影響患者病情變化,故對于嚴重燒傷的患者而言,盡快封閉創(chuàng)面是治療的重要環(huán)節(jié)。在創(chuàng)面修復過程中,角質(zhì)細胞移行不僅是創(chuàng)面再上皮化的起始事件,也是其限速步

2、驟[1],而角質(zhì)細胞的增殖則確保移行不斷進行,上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生使細胞運動能力增加,有利于細胞向創(chuàng)面遷移,故角質(zhì)細胞的生物學行為在封閉創(chuàng)面中發(fā)揮了重要作用。
　　眾所周知,嚴重燒傷后,無論是局部還是全身均可發(fā)生缺血缺氧?！靶菘诵摹钡陌l(fā)生使機體有效循環(huán)血容量銳減,組織灌流不足,機體處于缺血缺氧的狀態(tài)。在此基礎上,由于創(chuàng)面局部血管毀損、感染和呼吸爆發(fā)等造成耗氧量增加,所以創(chuàng)面周圍也處于低氧環(huán)境。臨床現(xiàn)象提示,包扎等短暫低氧環(huán)境可以

3、提高創(chuàng)面愈合速度[2-4],長期低氧則可造成創(chuàng)面不愈,慢性創(chuàng)面進行高壓氧治療也可加快創(chuàng)面愈合[5-7],這提示氧濃度閾值與作用時間閾值對創(chuàng)面修復細胞的行為有重要影響。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是機體內(nèi)重要的信號分子,在細胞生長、分化、凋亡等方面都發(fā)揮著重要作用[8-11],其兩種復合物mTORC1、mTORC2分別調(diào)節(jié)細胞生長和運動。許多研究表明缺氧會抑制mTOR信號通路,但是多種腫瘤組織在處于低氧環(huán)境的同時,其mTOR仍處于激

4、活狀態(tài),并與腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關[13-15]。鑒于創(chuàng)面愈合和腫瘤發(fā)生之間的相似性[16-20]及該信號通路在機體中的普遍性和重要性,mTOR通路在低氧環(huán)境下的創(chuàng)面愈合中處于何種狀態(tài),以及在再上皮化的過程中發(fā)揮了何種作用,均尚無文獻進行系統(tǒng)的報道,值得進行研究。
　　除了負壓裝置的臨床應用外,目前的研究都集中在體外低氧對創(chuàng)面愈合細胞生物學行為的影響,缺少實驗結果的在體應用。有文獻利用兩種對氧氣通透率差別很大的薄膜對創(chuàng)面進行

5、覆蓋[21],封閉7天,記錄創(chuàng)面氧分壓的動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)持續(xù)的低氧環(huán)境(7天)使得動物創(chuàng)面修復速度下降,愈合減緩。我們利用該參考文獻低氧模型制作方法并結合低氧作用的理論機制,考慮適當縮短體外低氧處理的時間,觀察短時間低氧處理對創(chuàng)面愈合的影響,找到促進創(chuàng)面修復的低氧時間閾值,最終使之應用于臨床。為了達到這一研究目的,我們在明確體外低氧作用的時間閾值對創(chuàng)面修復過程中細胞行為影響的基礎上,進一步利用在體低氧模型研究低氧對創(chuàng)面修復的影響,使之為臨

6、床促進創(chuàng)面修復提供新的參考。
　　材料與方法:
　　1、創(chuàng)面周圍低氧及細胞增殖情況
　　制作小鼠全層皮膚缺損模型,傷后1d、2d、3d、4d、7d、10d、14d取材,制作冰凍切片后,利用HypoxyprobeTM-1 Plus Kit做免疫熒光染色,紅色熒光即代表低氧區(qū)域。用 Image-Pro Plus軟件分析圖片,觀察創(chuàng)面周圍低氧的分布位置、程度、隨時間變化情況,通過免疫組化法染PCNA研究創(chuàng)面周圍細胞增殖情況。

7、
　　2、小鼠原代表皮細胞的分離與培養(yǎng)
　　取Balb/c乳鼠的皮膚,用DispaseⅡ溶液4°C過夜消化,次日用0.25％胰酶在37°C消化5-10min,期間不斷吹打,過濾除去皮膚碎片,離心后重新致懸,吸取10μL細胞混懸液計數(shù),調(diào)整細胞密度后將混懸液分裝至 T25培養(yǎng)瓶中,置于37°C、5%CO2培養(yǎng),注意觀察細胞生長形態(tài)、培養(yǎng)基顏色、渾濁度等情況。
　　3、短時間低氧處理對細胞運動能力、遷移能力的影響
　

8、　按照常規(guī)操作培養(yǎng)、消化HaCaT細胞(人表皮細胞株)后接種,并按照隨機數(shù)字表法分為對照組、低氧1h、3h、6h組,每組樣本數(shù)為6,每孔觀察細胞數(shù)不少于30。利用活細胞工作站實時觀察記錄各組細胞的運動情況,Image J軟件描繪出細胞運動軌跡,并統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析細胞運動能力的變化。接種HaCaT細胞后,根據(jù)隨機數(shù)字表法將細胞分為對照組、1h、3h、6h組,每組樣本數(shù)為8,用200μL的移液槍槍頭在培養(yǎng)孔底部均勻用力劃痕,進行相應低氧處理后繼

9、續(xù)置于 C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定時在顯微鏡下觀察并記錄拍照。
　　4、低氧處理對細胞增殖的影響
　　(1)按照常規(guī)操作消化 HaCaT細胞后接種在96孔板中,根據(jù)隨機數(shù)字表法將其分為對照組、低氧1h、3h、6h、9h、12h、24h組,每組有20孔,Cell Counting Kit-8(CCK8)法檢測各孔吸光度值,研究細胞增殖情況。(2)將HaCaT細胞隨機分為對照組、1h、3h、6h、24h組,每組樣本數(shù)為5,蛋白免疫印

10、跡法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)。
　　5、低氧處理對原代細胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)轉(zhuǎn)化的影響
　　分離培養(yǎng)小鼠原代表皮細胞,按照隨機數(shù)字表法分為對照組、低氧0.5h、1h、3h、6h、24h組,每組樣本數(shù)為6,Western Blot法檢測波形蛋白的表達變化;利用免疫細胞熒光法對對照組、低氧24h組進行染色,觀察波形蛋白的表達,同時免疫熒光染F-actin,觀察其分布及狀態(tài)。
　　6、低氧對Akt、P70S

11、6K及mTOR蛋白表達的影響
　　常規(guī)培養(yǎng)原代細胞后接種在培養(yǎng)皿中,根據(jù)隨機數(shù)字表把它們分為對照組、低氧10min、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h組,每組有6個樣本。Western Blot法檢測Akt、P70S6K、mTOR磷酸化程度及細胞中總的P70S6K、mTOR蛋白表達水平。
　　7、低氧處理對在體創(chuàng)面的影響
　　Balb/c小鼠脫毛后制作背部全層皮膚缺損模型,根據(jù)隨機數(shù)字表將實驗動物分為對照組、低

12、氧1h、3h、6h組,每組至少有5只。將氧氣通透率極低的polyvinylidene chloride(聚偏二氯乙烯)覆蓋小鼠背部左側(cè)的創(chuàng)面,營造低氧環(huán)境,將氧氣可自由通過的 polymethylpentene(聚甲基戊烯)膜覆蓋右側(cè)的創(chuàng)面作為其對照進行研究。處理完畢后即除去覆蓋的薄膜,將創(chuàng)面暴露在空氣中,觀察記錄小鼠創(chuàng)面愈合情況,利用Image-Pro Plus軟件分析,根據(jù)實驗目的需要適時取材。以低氧處理6h組為例,利用HE染色、M

13、asson染色、免疫組化染色觀察低氧處理創(chuàng)面與對照組的區(qū)別。
　　結果:
　　1、創(chuàng)面周圍低氧出現(xiàn)的位置、程度及時間依賴關系
　　創(chuàng)面形成2天后,創(chuàng)緣即可出現(xiàn)紅色熒光,說明創(chuàng)緣此時即處于缺氧狀態(tài),第3天時最為明顯。隨著時間的延長,紅色熒光強度逐漸減弱。創(chuàng)緣、創(chuàng)面移行的細胞可見棕黃色的陽性表達,說明表皮細胞增殖活躍。
　　2、小鼠原代表皮細胞的分離與培養(yǎng)結果
　　原代細胞生長良好,24h左右開始貼壁,細胞呈圓

14、形或橢圓形,體積較大,胞核體積也較大,細胞生長旺盛,輪廓清晰,折光性好,呈鋪路石樣狀態(tài),為下一步實驗奠定了基礎。
　　3、短時間低氧處理對細胞運動和遷移能力的影響
　　3.1、細胞運動距離:對照組細胞運動軌跡較集中,少有運動范圍較大的細胞,低氧1h、3h、6h組的細胞運動范圍依次增大,低氧6h組增加幅度最大。對照組、低氧1h、3h、6h組平均運動距離分別為(100.320±43.102)μm、(129.144±48.139)

15、μm、(134.828±43.005)μm、(169.183±54.588)μm。
　　3.2、細胞運動速度:觀察1h時,低氧1h、3h、6h組細胞軌跡速度分別為(43.315±18.429)、(43.965±16.305)、(55.005±19.471)μm/h,高于正常對照組的(33.832±13.450)μm/h(t=2.840~7.468,P<0.05或0.01),低氧6h組顯著高于低氧1h、3h組(t值分別為3.678、

16、3.924,P<0.05或0.01)。觀察2h時,低氧1h、3h、6h組細胞軌跡速度分別為(43.625±17.380)、(43.509±13.732)、(54.465±17.201)μm/h,高于正常對照組的(33.011±11.667)μm/h(t=3.936~8.465,P<0.01),低氧6h組顯著高于低氧1h、3h組(t值分別為3.474、4.043,P<0.05或0.01)。觀察3h時,低氧1h、3h、6h組細胞軌跡速度分別

17、為(43.048±16.046)、(44.943±14.335)、(56.394±18.196)μm/h,高于正常對照組的(33.440±10.23)μm/h(t值=3.600~9.330,P<0.01),低氧6h組顯著高于低氧1h、3h組(t值分別為4.545、4.475,P<0.01)。正常對照組、低氧1h、3h、6h組在不同時相點軌跡速度比較無差異(t=-0.523~0.596,P值均大于0.05)。
　　觀察1h時,低氧1

18、h、3h、6h組細胞位移速度分別為(22.295±11.374)、(19.445±13.732)、(31.555±19.12)μm/h,高于正常對照組的(15.219±9.985)μm/h(t=1.990~6.976, P<0.05或0.01),低氧6h組顯著高于低氧1h、3h組(t值分別為3.394、5.194,P<0.05或0.01)。觀察2h時,低氧3h、6h組細胞位移速度分別為(12.156±7.687)、(20.533±12.

19、747)μm/h,顯著高于正常對照組的(8.801±6.654)μm/h(t值分別為2.386、8.000,P<0.05或0.01),低氧6h組顯著高于低氧1h、3h組(t值分別為5.955、5.732,P<0.01)。觀察3h時,低氧3h、6h組細胞位移速度(9.884±6.411)、(17.051±11.743)μm/h,顯著高于正常對照組的(6.427±5.295)μm/h(t值分別為2.808、8.231,P<0.01),低氧6

20、h組顯著高于低氧1h、3h組(t值分別為6.008、5.558,P<0.01)。比較不同時相點位移速度,各組差異均有統(tǒng)計學意義。在觀察2h時,各組速度比觀察1h時顯著降低(t值=-7.036~-4.232, P均小于0.01);觀察3h時,各組速度比觀察1h時顯著降低(t=-8.208~-5.540,P均小于0.01),正常對照組觀察3h時比2h時下降(t=-1.967,P<0.05)。
　　3.3、劃痕實驗:體外低氧處理1h、3

21、h、6h均可促進細胞的側(cè)向遷移,并且隨著低氧處理時間的增加,其側(cè)向遷移趨勢也增大,以6h最為明顯。
　　4、低氧處理對細胞增殖的影響
　　4.1、CCK8法檢測結果:對照組、低氧1h、3h、6h、9h、12h、24h組吸光度值分別為1.110±0.069、1.358±0.099、1.387±0.047、1.379±0.049、1.104±0.14、1.063±0.089、0.992±0.064(F=39.19,P<0.01)

22、。與對照組相比,低氧1h、3h、6h組細胞增殖水平顯著增加(t=6.639~7.403,P<0.01),低氧24h組細胞增殖水平降低(t=-3.135, P<0.05)。低氧24h、12h、9h組顯著低于低氧1h、3h、6h組(t=-10.538~-6.775,P<0.05或0.01)。
　　4.2、Western Blot法檢測結果:對照組、低氧1h、3h、6h、24h細胞PCNA蛋白表達量為0.926±0.121、0.972±

23、0.142、1.621±0.18、0.945±0.09、0.661±0.21(F=20.11, P<0.01)。低氧1h、3h、6 h組細胞PCNA蛋白水平較對照組顯著增高(t=2.235~5.783, P<0.05或0.01);低氧24h組蛋白表達量較對照組降低(t=-1.998,P<0.05)。低氧3h組蛋白水平明顯高于低氧1h、6h組(t值為4.312、3.947,P<0.01)
　　5、低氧處理對原代細胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)

24、化(EMT)的影響
　　低氧環(huán)境處理后,免疫細胞熒光顯示表達波形蛋白的細胞數(shù)目增多,表達量增加。Western Blot結果顯示,對照組和低氧30min、1h、3h、6h及24h組波形蛋白表達量分別為0.319±0.09、0.983±0.22、1.03±0.11、1.392±0.43、1.329±0.13、1.317±0.14。免疫熒光顯示F-actin表達增多,向細胞周邊聚集轉(zhuǎn)移,形成較多的應力纖維、板狀偽足,呈衛(wèi)星狀分布在細胞

25、邊緣。
　　6、低氧對Akt、P70S6K和mTOR的影響
　　6.1、磷酸化的Akt:在對照組和低氧處理10min、30min、1h、3h、6h、12h和24h組,磷酸化Akt蛋白表達量分別為0.666±0.035、1.845±0.111、2.132±0.452、2.963±0.161、2.263±0.494、0.886±0.171、0.377±0.084、0.142±0.093。
　　6.2、P70S6K:在對照組

26、和低氧處理10min、30min、1h、3h、6h、12h和24h組,磷酸化的P70S6K蛋白表達量分別為0.744±0.156、1.771±0.312、1.639±0.374、2.013±0.227、1.791±0.484、1.679±0.231、0.549±0.197、0.268±0.066,蛋白樣本中總的P70S6K的表達量基本保持不變,各組分別為1.05±0.369、1.435±0.283、1.151±0.214、1.549±0

27、.472、1.578±0.17、1.348±0.724、0.603±0.226、0.657±0.361。
　　6.3、mTOR:磷酸化的mTOR(Ser2481)在對照組和各個處理組中表達量分別為0.62±0.190、1.133±0.286、1.5±0.298、1.967±0.473、1.931±0.449、1.876±0.324、0.878±0.342、0.22±0.082,同時細胞中總的mTOR在對照組和各個處理組中表達量為0

28、.865±0.051、1.003±0.122、0.961±0.226、1.410±0.242、1.517±0.289、1.468±0.185、0.9±0.298、0.92±0.42。
　　7、低氧處理對在體創(chuàng)面愈合過程的影響
　　于創(chuàng)面形成后24-48h(含缺氧時間)觀察創(chuàng)面面積,發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面經(jīng)低氧處理1h、3h、6h后,剩余面積均較對照組小,并在愈合過程中保持此趨勢。以低氧處理6h創(chuàng)面為例,HE染色顯示低氧處的表皮厚度較常氧處

29、明顯增加,PCNA免疫組化染色可見同一時間點低氧組處于增殖期的細胞數(shù)目較多。Masson染色見兩組創(chuàng)面處的膠原纖維較多,粗細不等,排列致密紊亂,周圍被均質(zhì)化的基質(zhì)包圍,未見明顯差異。HE染色、Masson染色可見到低氧組皮下的血管密度較高。
　　討論與結論：
　　1、本研究結果顯示,創(chuàng)面形成后第2天創(chuàng)緣出現(xiàn)缺氧狀態(tài),傷后第3天達到高峰。創(chuàng)緣表皮細胞增殖活躍,與創(chuàng)面缺氧分布的區(qū)域一致,從創(chuàng)緣移行到創(chuàng)面的表皮細胞也處于活躍的增殖

30、狀態(tài)。
　　2、短時間低氧處理可以促進細胞運動能力明顯增加?；罴毎ぷ髡居^察結果顯示,短時間低氧處理可以促進細胞運動能力明顯增加,低氧6h處理的增加幅度最大。劃痕實驗結果顯示,體外低氧處理可以促進角質(zhì)細胞的側(cè)向遷移,處理6h遷移距離最大,此結果和活細胞工作站的數(shù)據(jù)一致。
　　3、短時間低氧處理可促進細胞增殖和 EMT轉(zhuǎn)化,延長低氧時間可使細胞增殖受抑。CCK8法發(fā)現(xiàn)短時間低氧處理(1h、3h、6h)均促進細胞的增殖,低氧時間

31、延長到9h、12h、24h后細胞增殖減緩甚至受到抑制,Western Blot顯示低氧1h、3h、6h促進細胞增殖,低氧24h抑制細胞增殖;免疫細胞熒光、Western Blot結果顯示,低氧處理后原代表皮細胞波形蛋白的表達增加,F-actin分布位置及狀態(tài)發(fā)生改變,提示低氧可以促進EMT轉(zhuǎn)化。
　　4、短時間低氧處理引起mTOR信號激活,可能是體外低氧刺激表皮細胞使其生物學行為發(fā)生改變的機制。Western Blot結果顯示,短

32、時間低氧處理(30min、1h、3h、6h)引起mTORC1、mTORC2信號激活,隨著低氧時間的延長其激活水平逐漸下降,低氧處理24h會抑制該信號通路。
　　5、動物實驗結果顯示,創(chuàng)面短時間低氧處理可使增殖活躍的細胞增多,血管密度增加,愈合速度加快。低氧處理的創(chuàng)面愈合后表皮厚度增加,PCNA免疫組化染色可見創(chuàng)面增殖活躍的細胞增多;HE染色和Masson染色可見低氧創(chuàng)面的血管密度較高;創(chuàng)面低氧處理1h、3h、6h后,創(chuàng)面愈合速度加