人卵巢組織玻璃化冷凍保存方案的初步探討.pdf

1、早期診斷、有效地放化療以及骨髓移植的應(yīng)用，明顯改善了腫瘤的治療效果，大大提高了腫瘤患者的生存率。但對(duì)于年輕的女性患者而言，生存率的提高并不意味著生活質(zhì)量的提高。因?yàn)槁殉步M織對(duì)這些細(xì)胞毒性治療尤其是烷化劑及放療特別敏感，有可能導(dǎo)致女性生殖內(nèi)分泌功能的喪失。多方面的研究已經(jīng)證實(shí)對(duì)這些患者實(shí)施卵巢組織冷凍保存是有效的。卵巢組織中存在大量的卵泡，如果能夠有效地將其冷凍保存，需要時(shí)解凍并加以利用，必將為生命科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展提供豐富的資源和強(qiáng)有力的

2、研究平臺(tái)。
　　 近年卵巢組織冷凍研究發(fā)展迅速，并逐漸成為生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。玻璃化冷凍技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的冷凍保存技術(shù)，目前已在胚胎冷凍保存方面得到廣泛的應(yīng)用，相繼有學(xué)者報(bào)道了玻璃化冷凍成功保存鼠、兔、羊、猴等卵巢組織的研究，并證實(shí)玻璃化冷凍可以成為保存卵巢組織功能較為有效的手段。
　　 目的：
　　 當(dāng)前卵巢組織玻璃化冷凍保存還沒(méi)有統(tǒng)一的冷凍方案，包括冷凍保護(hù)劑和冷凍載體。國(guó)內(nèi)的卵巢組織玻璃

3、化冷凍尚處于探索階段，本次研究通過(guò)觀察新鮮和凍融后的卵巢組織的某些生理特點(diǎn)，著重探討不同玻璃化冷凍方案對(duì)人卵巢組織冷凍的效果，初步比較不同濃度玻璃化冷凍保護(hù)劑以及不同的冷凍載體對(duì)人卵巢組織玻璃化冷凍效果，初步建立一種人卵巢組織玻璃化冷凍方案。
　　 材料與方法：
　　 1材料：
　　 2008年8月至2009年3月間，本研究募集了20例因卵巢囊腫需要手術(shù)的患者，年齡為24-38歲(29.79±4.14)。活檢卵巢

4、組織均通過(guò)腹腔鏡下獲得，在進(jìn)行囊腫剝離術(shù)后剪下附于囊腫壁上且無(wú)明顯血栓的卵巢組織片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 2方法：
　　 2.1卵巢組織的處理
　　 將取得的卵巢組織片置于裝有生理鹽水液的試管內(nèi)并放入冰桶中保存，30分鐘內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，在磷酸鹽緩沖液中反復(fù)漂洗、去除髓質(zhì)，將卵巢皮質(zhì)片切割成2*2*1mm3大小的組織塊，放在磷酸鹽緩沖液中備用。隨機(jī)選取部分組織塊置于中性福爾馬林液中固定作新鮮對(duì)照組。
　　 2.2卵

5、巢組織玻璃化冷凍保存
　　 采用低濃度比二甲基亞砜(DMSO)和乙二醇(EG)為玻璃化Ⅰ組，高濃度比為玻璃化Ⅱ組。將部分人卵巢組織塊在平衡液和兩種玻璃化冷凍液中暴露一定的時(shí)間后分別經(jīng)微滴法、麥管法和堅(jiān)硬表面玻璃化法(SSV)投入液氮中進(jìn)行玻璃化冷凍保存。
　　 2.3卵巢組織冷凍復(fù)蘇及體外培養(yǎng)
　　 采用三步復(fù)蘇法將冷凍保存的組織顆粒逐個(gè)復(fù)蘇，隨機(jī)選取部分復(fù)蘇后的卵巢組織塊置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，每48小時(shí)

6、收集培養(yǎng)上清液，離心、等待測(cè)激素水平。將剩余組織塊及培養(yǎng)結(jié)束后的組織塊中性固定后等待組織學(xué)檢查。
　　 2.4組織學(xué)檢查及激素水平測(cè)量
　　 每四個(gè)組織塊為一待檢平面行石蠟包埋，每個(gè)石蠟塊以4μm厚度切片，行HE染色。以RIA測(cè)定上清液中雌二醇(estradiol，E2)水平，以評(píng)定凍融后卵巢組織的內(nèi)分泌功能。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 利用SSPS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間原始卵泡形態(tài)正常率行x

7、2檢驗(yàn)分析，組間凋亡率比較行單因素方差分析，體外培養(yǎng)兩周各組間激素分泌量行隨機(jī)配對(duì)方差分析，以α=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1冷凍對(duì)人卵巢組織間質(zhì)及各級(jí)卵泡比例和形態(tài)學(xué)的影響
　　 1.1冷凍對(duì)人卵巢組織間質(zhì)的影響
　　 新鮮人卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞排列緊密且規(guī)律，將各級(jí)卵泡緊密的包裹在卵巢皮質(zhì)內(nèi)。與新鮮對(duì)照組相比，兩種玻璃化冷凍方案冷凍保存的卵巢組織，復(fù)蘇后均可見(jiàn)卵巢組織內(nèi)部分間質(zhì)細(xì)胞分離，但原

8、始卵泡變化不明顯。體外培養(yǎng)后卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞間連接疏松、甚至斷裂形成裂隙，細(xì)胞排列紊亂。
　　 1.2冷凍對(duì)人卵巢組織內(nèi)各級(jí)卵泡比例和形態(tài)學(xué)的影響
　　 與新鮮組相比，兩冷凍組原始卵泡的數(shù)目和正常形態(tài)率都有不同程度的下降，但玻璃化Ⅰ組原始卵泡正常形態(tài)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，玻璃化Ⅱ組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩冷凍組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。新鮮組與各冷凍組初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡數(shù)目均較少，本次

9、研究中不再對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 2冷凍對(duì)人卵巢組織中各類細(xì)胞凋亡情況的影響
　　 卵巢組織內(nèi)原始卵泡、初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞以及顆粒細(xì)胞內(nèi)均未見(jiàn)凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)；而卵巢組織內(nèi)部分間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)的凋亡細(xì)胞，呈棕色或棕褐色。與新鮮對(duì)照組相比，玻璃化冷凍各組卵巢組織內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3冷凍對(duì)復(fù)蘇后卵巢組織分泌E2的影響
　　 組織體外培養(yǎng)期間，各凍融組