雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞P13K-AKT-mTOR通路的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、目的:雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制侵襲、抑制血管生成等作用。雷帕霉素的主要作用機(jī)制是與免疫親和蛋白(FKBP12)結(jié)合形成RAPA-FKBP12復(fù)合物，作用于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mTOR)上從而阻斷細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，從而減少其下游分子4EBP-1、P70S6KB的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞周期和蛋白的合成以促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且通過抑制VEGF、HIF1α的表達(dá)抑制血管新生和降低

2、腫瘤細(xì)胞的侵襲性及轉(zhuǎn)移。
　　慢性粒細(xì)胞白血病是一種骨髓增殖性腫瘤，95％的CML患者具有BCR/ABL融合基因陽(yáng)性。雖然TKIs應(yīng)用使CML的治療取得了重大的突破，但其存在耐藥問題，因此需要尋找其他的治療方法。
　　本實(shí)驗(yàn)擬在研究雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞的PI3K/AKT/mTOR途徑的下游分子4EBP1、P70S6KB、VEGF、HIF1α的影響，及通過電鏡了解應(yīng)用雷帕霉素后K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，并通過酶組織化學(xué)染色了

3、解雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞溶酶體及線粒體的影響。為雷帕霉素治療慢性粒細(xì)胞白血病提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　方法:體外培養(yǎng)K562細(xì)胞，在不同濃度雷帕霉素中干預(yù)24h，應(yīng)用CCK8法檢測(cè)雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用。根據(jù)CCK8的檢測(cè)結(jié)果分別選取0nmol/L、80nmol/L、160nmol/L、320nmol/L濃度的雷帕霉素處理K562細(xì)胞24h，后采用Western Blot方法檢測(cè)4EBP1、VEGF分子的表達(dá)情況，采用R

4、T-PCR方法檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR途徑的下游分子4EBP1、P70S6KB、VEGF、HIF1α的表達(dá)情況及BCR/ABL和SHIP的表達(dá)情況;應(yīng)用電鏡及NADH染色、酸性磷酸酶(ACP)染色了解雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)及線粒體、溶酶體的影響。
　　結(jié)果:
　　1.隨著雷帕霉素濃度的增高對(duì)K562細(xì)胞的抑制率明顯上升(P＜0.05）。
　　2.隨著雷帕霉素濃度增高4EBP1、VEGF在蛋白水平的表達(dá)降低(

5、P＜0.05)。
　　3.隨著雷帕霉素濃度的增高4EBP1、P70S6BK、VEGF、HIF1α分子在mRNA水平表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。
　　4.隨著雷帕霉素濃度的增高細(xì)胞在電鏡下出現(xiàn)的凋亡程度加重，在酶組織化學(xué)染色顯示對(duì)溶酶體及線粒體細(xì)胞損傷加重。
　　5.雷帕霉素對(duì)SHIP基因和BCR/ABL融合基因(P＞0.05）無明顯作用。
　　結(jié)論:
　　1.雷帕霉素可以抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)K56