重組Sj-Ts4樣蛋白在日本血吸蟲(chóng)病免疫診斷中的初步應(yīng)用.pdf

1、目的：為了尋找血吸蟲(chóng)病新的免疫學(xué)診斷候選分子，在大腸桿菌中高效表達(dá)并純化日本血吸蟲(chóng)Sj-Ts4樣融合蛋白，建立重組抗原間接ELISA方法(rSj-Ts4-ELISA)診斷日本血吸蟲(chóng)病。 方法：提取日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)RNA，設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR法擴(kuò)增出日本血吸蟲(chóng)sj-Ts4樣蛋白基因編碼基因序列，T載體連接，再將其亞克隆入pGEX-5X-1載體中，經(jīng)酶切、測(cè)序證實(shí)正確后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α并用IPTG對(duì)該重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，親和層

2、析分離純化得到MW為58KD帶有GST標(biāo)簽的重組Si-Ts4樣融合蛋白，SDS-PAGE和'Western blot驗(yàn)證表達(dá)量和免疫活性。后換用pET28a(＋)表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)得到MW為32KD帶有HIS標(biāo)簽的重組Sj-Ts4樣融合包涵體蛋白，將純化、復(fù)性后的rSj-T4樣蛋白和SjAWA包被反應(yīng)板，確定其最適抗原包被量和血清稀釋度，用rSj-Ts4-ELISA、sjAWA-ELISA和SEA-IHA方法平行檢測(cè)34份急性、16份慢

3、性和24份晚期血吸蟲(chóng)病患者血清；32份其他寄生蟲(chóng)病患者血清(24份華支睪吸蟲(chóng)病患者血清，8份鉤蟲(chóng)病患者血清)以及30份正常對(duì)照者血清，比較不同方法之間敏感性，特異性以及交叉反應(yīng)性。 結(jié)果：RT-PCR法擴(kuò)增出一條大小約為819bp大小的Sj-Ts4樣蛋白的DNA片斷，將其亞克隆表達(dá)質(zhì)粒pGEX-5X-1，測(cè)序證實(shí)具有完整的ORF。誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE可見(jiàn)一條約58KDa大小的GST融合蛋白條帶，親和層析法純化出Sj-

4、Ts4樣蛋白，Western-blot顯示Sj-Ts4樣蛋白能夠與抗GST特異性抗體反應(yīng)。將目的基因轉(zhuǎn)入表達(dá)質(zhì)粒pET28a(＋)，同樣經(jīng)SDS-PAGE可見(jiàn)一條約32KDa大小的HIS融合蛋白條帶。該融合蛋白為包涵體蛋白，經(jīng)變性、純化后，用復(fù)性的rSj-Ts4樣蛋白作為抗原做ELISA、與SjAWA-ELISA和SEA-IHA方法平行檢測(cè)急、慢性和晚期血吸蟲(chóng)病患者，華支睪吸蟲(chóng)病患者、鉤蟲(chóng)病患者和正常對(duì)照者血清，結(jié)果顯示：rSj-Ts4

5、-ELISA和SjAWA-ELISA，對(duì)于上述34份急性血吸蟲(chóng)病患者血清檢測(cè)的敏感性分別為97.1％和100.0％，經(jīng)校正x2檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異(x2=1.02，p>0.05)；16份慢性血吸蟲(chóng)病患者血清，rSj-Ts4-ELISA和SjAWA-ELISA檢測(cè)的敏感性分別為100.0％和100.0％，無(wú)差異；24份晚期血吸蟲(chóng)病患者血清，rSj-Ts4-ELISA和SjAWA-ELISA檢測(cè)的敏感性分別為87.5％和75.0％，經(jīng)校正x2檢

6、驗(yàn)無(wú)顯著性差異(x2=1.23，p>0.05)；30份正常人血清，兩種檢測(cè)方法的假陽(yáng)性率分別為6.7％和3.3％，經(jīng)校正x2檢驗(yàn)也無(wú)顯著性差異(x2=0.35，p>0.05)；32份其他寄生蟲(chóng)病患者血清(華支睪吸蟲(chóng)病患者血清24份，鉤蟲(chóng)病患者血清8份)，rSj-Ts4-ELISA和SjAWA-ELISA檢測(cè)的血清抗體的陽(yáng)性率分別為12.5％和25.0％，經(jīng)校正x2檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異(x2=1.64，p>0.05)。rSj-Ts4-ELIS

7、A和SEA-IHA，對(duì)于34份急性血吸蟲(chóng)病患者血清檢測(cè)的敏感性分別為97.1％和82.4％，經(jīng)校正x2檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異(x2=3.98，p>0.05)；16份慢性血吸蟲(chóng)病患者血清，rSj-Ts4-ELISA和SEA-IHA檢測(cè)的敏感性分別為100.0％和68.7％，經(jīng)校正x2檢驗(yàn)有顯著性差異(x2=5.93，p<0.05)；24份晚期血吸蟲(chóng)病患者血清，rSj-Ts4-ELISA和SEA-IHA檢測(cè)的敏感性分別為87.5％和50.0％，經(jīng)

8、校正x2檢驗(yàn)有顯著性差異(x2=7.86，p<0.05)；30份正常人血清，兩種檢測(cè)方法的假陽(yáng)性率分別為6.70％和0.00％，經(jīng)校正x2檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異(x2=2.07，p>0.05)；32份其他寄生蟲(chóng)病患者血清(華支睪吸蟲(chóng)病患者血清24份，鉤蟲(chóng)病患者血清8份)，rSj-Ts4-ELISA和SEA-IHA檢測(cè)的血清抗體的陽(yáng)性率分別為12.5％和9.4％，經(jīng)校正x2檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異(x2=0.10，p>0.05)。在實(shí)驗(yàn)室中rSj-Ts

9、4-ELISA法診斷急、慢性和晚期血吸蟲(chóng)病，與SjAWA-ELISA法有著相似的敏感性、特異性，與SEA-IHA法相比在檢測(cè)慢性和晚期血吸蟲(chóng)病患者血清中抗體的試驗(yàn)中重組抗原取得較好的敏感性。且本法操作簡(jiǎn)便，易于標(biāo)準(zhǔn)化。本研究rSj-Ts4樣蛋白在診斷中的交叉反應(yīng)少，表明rSj-Ts4樣蛋白在血吸蟲(chóng)病免疫診斷上具有較大的應(yīng)用潛能。 結(jié)論：本研究擴(kuò)增克隆了Sj-TS4樣蛋白基因，在原核細(xì)胞中表達(dá)并純化了Sj-Ts4樣蛋白，以此rSj