日本血吸蟲重組膜外蛋白rSj29免疫診斷的初步應用及代謝抗原單克隆抗體的制備.pdf

1、血吸蟲病在我國分布廣泛，危害嚴重，至今仍是重要的公共衛(wèi)生問題?？焖?，準確的早期診斷在血吸蟲病的防治中起著重要作用。血吸蟲病的診斷主要有病原學檢查和免疫學檢查，病原學診斷是確診病人的主要方法，但費時，費力，對慢性感染和低度感染者容易漏檢。因此尋找高度敏感、特異以及建立經濟、可靠、能夠考核療效的免疫診斷方法依然是當前血吸蟲病基礎研究的重要內容。本實驗室在前期已克隆表達了重組日本血吸蟲四跨膜超家族蛋白（SjTsp2-A）和29 000膜外蛋白

2、（Sj29），rSj29 ELISA在實驗室用于血吸蟲病人血清循環(huán)抗體的檢測，獲得較好的敏感性和特異性。我們重新純化了rSj29蛋白和rSjTsp2蛋白，用30份混合陽性血清及30份混合陰性血清進行間接酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的預實驗，確定了最佳抗原包被濃度、二抗?jié)舛?。隨后，從血吸蟲病低度流行區(qū)蕪湖南陵縣采集394份糞便標本，男女隨機，年齡5-80歲，改良加藤法三送九檢，或集卵孵化法檢測，同時采集其血清，進行間接血凝試驗（糞便檢查

3、和間接血凝試驗，由安徽省血吸蟲病防治研究所完成），用rSj29間接ELISA法和AWA間接ELISA法檢測血清相應抗體，每個樣本均作復孔，采用單盲法檢測，并與間接血凝試驗和糞檢方法進行了比較。結果顯示陽性率：糞檢，IHA，rSj29-ELISA，AWA-ELISA陽性率分別為4.82％（19/394），62.18％（245/394），68.27％（269/394)和89.85％（354/394)。其中血清學檢測的陽性率均顯著高于糞檢（x

4、2=1259.7，P<0.01），IHA與AWA-ELISA符合率為63.20％，均為陽性者為227例，均為陰性者為22例；IHA與rSj29-ELISA符合率為80.71％，均為陽性者為219例，均為陰性者為99例。IHA與rSj29-ELISA的符合率較高。IHA與糞檢結果比較，其敏感度，特異度，與糞檢符合率分別為100％，39.73％，42.64％；rSj29-ELISA分別為94.74％，33.33％，36.04％；AWA-EL

5、ISA分別為100％，10.67％，14.97％。rSj29-ELISA與IHA敏感性（P=0.5）和特異性（x2=3.56，P>0.05）差異無統計學意義。rSj29-ELISA與AWA-ELISA相比敏感性差異無統計學意義（P=0.5），特異性rSj29-ELISA高于AWA-ELISA（x2=55.98，P<0.05）。表明rSj29間接ELISA法診斷日本血吸蟲病與IHA相比具有相似的敏感性和特異性，且制備方法簡單，易于標準化，

6、可用于血吸蟲病的免疫診斷初篩。
　　 但ELISA和IHA法的特異性較低，抗體檢測難以區(qū)分過去感染(包括經化療治愈者)與現癥感染，陽性率并非真實地反映現癥病人。而循環(huán)抗原檢測能更確切地反映療效，更可靠地判斷宿主體內有無活蟲存在，提供準確的治療依據及流行病學資料。隨著單克隆抗體技術的出現和完善，現多用單克隆抗體技術進行循環(huán)抗原檢測。
　　 為此我們制備了抗日本血吸蟲代謝抗原（Sj-Mag）的單克隆抗體。將尾蚴常規(guī)感染家兔，

7、42天時處死家兔，門靜脈灌注獲得日本血吸蟲成蟲，通過體外培養(yǎng)制備了日本血吸蟲成蟲代謝抗原，鑒定該蛋白具有免疫反應性，能夠識別日本血吸蟲病人血清。蛋白免疫小鼠6周后，測定小鼠免疫效價達1：32 000以上。小鼠尾靜脈注射純蛋白以加強免疫，三天后取小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行雜交融合，HAT選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，間接ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清，篩選陽性克隆，經三次亞克隆及擴大培養(yǎng)，獲得了兩株能夠穩(wěn)定分泌抗Sj-Mag的單克隆