人HT036基因檢測、功能研究及蛋白表達(dá).pdf

1、深度燒傷常常導(dǎo)致患者發(fā)生增生性瘢痕，臨床表現(xiàn)為色紅、突出和質(zhì)硬。往往給患者身心帶來嚴(yán)重傷害。增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)制已成為燒傷修復(fù)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。 我們在前期研究中選用含4096個人類基因的表達(dá)譜芯片對5例增生性瘢痕患者及自身正常皮膚進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，發(fā)現(xiàn)其中一個基因P311引人注目，它在燒傷病人早期增生性瘢痕組織中表達(dá)顯著增高。P311蛋白不屬于任何一種已知蛋白家族，對其功能少有研究。Pan等發(fā)現(xiàn)P311基因可以誘導(dǎo)TGF-

2、β<,1>非依賴的肌成纖維細(xì)胞表型樣改變。Fujitani等證實腺病毒介導(dǎo)的P311基因上調(diào)可以促進(jìn)大鼠面神經(jīng)損傷側(cè)軸突再生。為進(jìn)一步探討P311基因在增生性瘢痕中的潛在分子機(jī)制，我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以融合Gal4 DNA結(jié)合域的P311為誘餌蛋白，篩選了成人肝cDNA文庫，獲得了與P311相互作用的候選蛋白HT036。 HT036基因做為一功能未知新基因，其序列由Xu等在2001年首次提交基因庫，編碼一胞內(nèi)蛋白。為探討HT

3、036基因在增生性瘢痕形成中的可能機(jī)制，我們首先檢測了該基因在增生性瘢痕和同體正常皮膚中的表達(dá)差異，隨后觀察了HT036基因在成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用，最后在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)該蛋白，為后續(xù)研究做準(zhǔn)備。 研究內(nèi)容和方法 一、HT036基因在增生性瘢痕和同體正常皮膚中表達(dá)差異。 樣本經(jīng)PBS清洗，提取組織總RNA，通過RT-PCR試劑盒檢測HT036mRNA表達(dá)量，為保證RT-PCR在線性范圍，擴(kuò)增選取30個循環(huán)。

4、采用β-actin為內(nèi)對照，并用軟件Quantitv One分析表達(dá)量。 二、HT036和P311在成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用研究。 通過PCR獲得人HT036編碼基因，經(jīng)EcoR Ⅰ和SaL Ⅰ雙酶切，克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N2，經(jīng)酶切和測序鑒定正確。人胚肺成纖維細(xì)胞株(MRC-5)購自美國ATCC，采用含10％小牛血清、100U/ml青霉素G、100ug/ml鏈霉素DMEM培養(yǎng)。采用Lipofectamine<

5、'TM>2000轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞，48小時提取細(xì)胞總蛋白，通過Western blot檢測α-SMA和內(nèi)參GAPDH，并用軟件Quantity One分析表達(dá)量。采用同樣的方法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，收集72小時培養(yǎng)上清，用ELIsA檢測纖維化相關(guān)指標(biāo)TGF—β1，MMP-2，MMP-9。 三、HT036蛋白原核表達(dá)、鑒定和誘導(dǎo)動力學(xué)研究 我們按前述方法構(gòu)建原核表達(dá)載體pE3730a(+)-HT036，經(jīng)酶切和測序鑒定正確

6、后，重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DE3(BL21)pLysS菌株。通過IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并用特異性His抗體鑒定，并且對IPTG最佳誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)濃度進(jìn)行分析。 研究結(jié)果 一、HT036基因在增生性瘢痕和同體正常皮膚中表達(dá)差異。 3例患者的HT036表達(dá)在增生性瘢痕組織中都降低，與同體正常皮膚相比，分別降低70％，75％和46％。 二、HT036和P311在成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用研究。 HT036

7、抑制MRC-5細(xì)胞α-SMA表達(dá)，而P311誘導(dǎo)其表達(dá)。α-SMA相對表達(dá)量在空白組、HT036組、P311組和共轉(zhuǎn)染組分別為0.13，0.03，0.18，0.05。HT036降低293細(xì)胞TGF-β 1，MMP-2，MMP-9的分泌。與P311組相比，分別降低46.4％，33％希129％。 三、IIT036蛋白原核表達(dá)、鑒定和誘導(dǎo)動力學(xué)研究 成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a(+)-HT036，并在大腸桿菌中成功表達(dá)。