TPO+HGF+Il-3方案對人骨髓源性肝干細胞各亞群體外擴增的促進作用.pdf

1、在從事骨髓干細胞的相關(guān)研究中，某些實驗研究證明了骨髓中部分干細胞具有向肝系細胞分化的潛能，于是就提出了“骨髓源性肝干細胞(bonemarrow-derived liver stem cell)”這一概念。骨髓源性肝干細胞(BMDLSC)是肝干細胞的肝外重要來源，能夠在特定條件下分化成為肝細胞樣細胞甚至是肝細胞，進而在肝臟的修復與重建中扮演重要的角色。就目前而言，自體骨髓干細胞移植治療肝硬化作為治療肝硬化的一種新方法，是世界上最前沿、最熱

2、門的醫(yī)療技術(shù)之一。其原理是將患者健康的骨髓分離出干細胞，并將分離純化干細胞經(jīng)肝動脈或門靜脈再回輸至病肝內(nèi)，并讓這些干細胞在肝內(nèi)“落戶”發(fā)揮功能。在臨床工作中，肝移植面臨著肝源短缺、費用昂貴等問題，而骨髓源性肝干細胞的自體移植，則具有取材方便，易于體外擴增，而且不存在組織配型及免疫排斥等優(yōu)勢。但是，人體骨髓中的間充質(zhì)干細胞含量極少，大約每104～105個單個核細胞中含有1個間充質(zhì)干細胞(MSC)[1]，而臨床應(yīng)用骨髓干細胞移植治療疾病則需

3、要具備一定的數(shù)量以及較高的純度，因此，人骨髓源性肝干細胞的體外純化培養(yǎng)擴增、鑒定和各個干細胞亞群擴增情況的了解分析就顯得尤為重要。
　　 在體外誘導MSC分化成為肝樣細胞甚至肝細胞，一些維持細胞功能、誘導細胞分化的刺激因素是必不可少的，例如生長激素、細胞因子、細胞外基質(zhì)或者與其他類型的細胞共同培養(yǎng)。目前，關(guān)于骨髓源性肝干細胞的誘導分化培養(yǎng)模式國內(nèi)外尚未形成統(tǒng)一的標準。各種培養(yǎng)模式所用的細胞因子不同，有單一使用某種細胞因子，也有聯(lián)

4、合多種細胞因子的。本研究小組探討了
　　 TPO+HGF+IL-3組合培養(yǎng)方案，建立了一種穩(wěn)定的分離純化并能有效擴增干細胞的途徑，為獲得大量純化的骨髓源性肝干細胞并進而研究其作為種子細胞治療疾病提供了相關(guān)實驗基礎(chǔ)。肝細胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）為肝再生的特異性因子，與其受體c-met相結(jié)合而起作用，特別是在細胞密度較低的情況下，肝細胞生長因子對肝干細胞的遷移、增殖起基礎(chǔ)作用，能有效的誘

5、導肝干細胞分化為肝細胞，并且此作用效果與HGF的濃度有關(guān)系。白細胞介素-3(Interleukin-3，IL-3)和血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)等亦在骨髓源性肝干細胞的增殖分化誘導中起著重要的調(diào)節(jié)性作用。
　　 迄今為止，科研人員尚未發(fā)現(xiàn)可直接鑒定骨髓源性肝干細胞的特征性表面標志，其在骨髓干細胞衍生過程中的具體譜系定位也不太清楚，但是相關(guān)研究表明表達CD90、CD105、CD117、CD184、CD326

6、細胞表型的是具有肝干細胞潛能的細胞亞群[2、3]。
　　 本實驗應(yīng)用非連續(xù)性梯度密度離心法（Percoll分離液）從人骨髓中分離出富含目標細胞的細胞組分。采用TPO+HGF+IL-3的聯(lián)合培養(yǎng)方案，骨髓源性肝干細胞的體外擴增調(diào)整初始擴增的細胞密度為2.50×106/ml。實驗組為添加有血小板生成素(TPO)50ng/ml、促肝細胞生長素(HGF)40μg/ml、白細胞介素-3(IL-3)10ng/ml的高糖DMEM培養(yǎng)基體系，對

7、照組則不含TPO+HGF+IL-3，倒置相差顯微鏡下觀察誘導分化細胞胞體大小、形態(tài)、核仁數(shù)目及核漿比例的變化，分別在第1、7、14天，計算培養(yǎng)細胞總數(shù)，并采用流式細胞技術(shù)分別測算表達CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人骨髓源性肝干細胞各亞群的比例變化及增長倍數(shù)等。建立了一種能穩(wěn)定分離、純化、培養(yǎng)并有效擴增骨髓多能前體干細胞的方法，為獲得足量的純化的骨髓源性肝干細胞并進而研究其作為種子細胞治療多種臨床疾病提供了實驗

8、基礎(chǔ)。實驗結(jié)果顯示表達CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人骨髓源性肝干細胞各亞群的數(shù)量變化在第7天分別為4.94、4.89、6.70、5.72、5.03倍，及第14天數(shù)量增長倍數(shù)為7.60、7.76、11.70、21.38、8.12倍。從數(shù)據(jù)分析中可見實驗組中的各個亞群均有穩(wěn)步的增長，其中以表達CD184的亞群增加最為迅速。本實驗證實了TPO+HGF+IL-3方案能夠穩(wěn)定培養(yǎng)和擴增骨髓源性肝干細胞，此組合培養(yǎng)方案

9、對人骨髓源性肝干細胞各亞型的體外擴增有明顯的促進效果，其中以表達CD184亞群的擴增效果最為明顯。
　　 本課題的特點及意義:采用了TPO+HGF+IL-3細胞體外培養(yǎng)方案，促進骨髓源性肝干細胞的擴增，選擇了五個人骨髓源性肝干細胞的亞群，了解不同的亞群在此方案的作用下數(shù)量有何變化及關(guān)系，探討了此方案下不同的亞群總體數(shù)量及比例的變化，增長最明顯的亞群，在臨床應(yīng)用方面，為進一步的人體應(yīng)用骨髓源性肝干細胞的治療相關(guān)疾病的提供了實驗依據(jù)

10、。
　　 材料和方法:
　　 1.骨髓源性肝干細胞的分離純化培養(yǎng)
　　 1.1骨髓來源
　　 所取骨髓量約10ml至15ml，這些骨髓取自2011年05月至2011年10月之間南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院骨科手術(shù)患者（無血液系統(tǒng)疾病），標本為隨機選取骨科手術(shù)，取髂骨內(nèi)所含骨髓七份;健康成人髂前上棘骨髓一份;最終納入實驗的總共有八份。
　　 1.2主要試劑
　　 percoll分離液（pharm

11、acia），高糖DMEM(GIBCO)，PBS緩沖液(newprobe)，促肝細胞生長素（HGF，吉林華康），促血小板生長素(TPO，peprotech)，白細胞介素3(IL-3，peprotech)，熒光標記抗人抗體CD90-FITC、CD105-APC、CD117-PE、CD184-APC、CD326-PE(eBioscience)、胎牛血清(FCS，Hyclone)、0.25％胰酶(Hyclone)、青霉素和鏈霉素。
　　

12、 1.3實驗方法
　　 1.3.1目標細胞的分離
　　 使用percoll作為分離液，分成60％(1.077 g/ml)、50％(1.067 g/ml)、40％(1.056 g/ml)、30％(1.043 g/ml)四個密度梯度，取新鮮抗凝人骨髓10-15ml，經(jīng)percoll液不連續(xù)密度梯度離心分離，選取密度為40％-50％之間的細胞組分。
　　 1.3.2目標細胞的培養(yǎng)
　　 調(diào)整細胞起始的培養(yǎng)密度為

13、2.50×106個/ml，培養(yǎng)環(huán)境為1ml，培養(yǎng)面積為2cm2。實驗組為:加入血小板生成素(TPO)50ng/ml、促肝細胞生長素(HGF)40μg/ml、白細胞介素-3(IL-3)10ng/ml含10％血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系;對照組則為含10％血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系。細胞于37℃、5％CO2孵育箱中培養(yǎng)，每3～4 d更換一次培養(yǎng)基。
　　 1.3.3細胞計數(shù)及形態(tài)學變化
　　 分別于培養(yǎng)的第1、7、14天，

14、將細胞計數(shù)板，蓋玻片用10％的酒精擦干凈。將蓋玻片蓋子計數(shù)板上。常規(guī)準備細胞懸液，吹勻，抽取少量，由蓋玻片邊緣加入。計算四大格的細胞數(shù)。按如下公式:細胞數(shù)/ml=四大格/4×104×稀釋倍數(shù)。
　　 倒置相差顯微鏡下觀察誘導分化培養(yǎng)細胞胞體大小、形態(tài)、核仁數(shù)目及核漿比例的變化。
　　 2.人骨髓源性肝干細胞各細胞亞型的擴增情況
　　 2.1流式細胞儀檢測各亞群的數(shù)量變化
　　 采用上述培養(yǎng)方案后，分別于培

15、養(yǎng)的第1、7、14天，用胰酶消化貼壁細胞后，計數(shù)，在100μl環(huán)境中按5×105個細胞分別加入5μl抗人CD90-FITC、5μl抗人CD105-APC、20μl抗人CD117-PE、20μl抗人CD184-APC、20μl抗人CD326-PE，于冰上避光孵育30 min，600 g離心3 min，去除上清，后用PBS吹打均勻細胞，再次600g離心3min，清洗2次，1％多聚甲醛固定;迅速行流式細胞儀(BD公司FACS Caliber)

16、檢測CD90、CD105、CD117、CD184、CD326細胞所占的百分率。
　　 2.2數(shù)據(jù)處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，行獨立樣本t檢驗，非參數(shù)秩和檢驗;結(jié)果以均值±標準差表示;P＜0.05差別有顯著意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變
　　 培養(yǎng)初期，相差顯微鏡下實驗組與對照組細胞生長無明顯差別，細胞均成纖維樣生長，有一定的方向性，集落呈旋渦狀和火焰狀

17、，但實驗組細胞生長較旺盛。培養(yǎng)中期，實驗組原長梭型細胞逐漸變圓，細胞集落間相互融合成單層，長滿整個培養(yǎng)瓶，細胞排列呈平行狀或漩渦狀。對照組細胞到培養(yǎng)后期原長梭型細胞仍為梭形，但細胞質(zhì)折光性差，考慮為老化現(xiàn)象。培養(yǎng)后期，傳代培養(yǎng)的細胞生長速度較原代培養(yǎng)明顯增快，不再形成細胞集落，4-5d即可鋪滿瓶底。
　　 2.目標細胞的增長總數(shù)
　　 培養(yǎng)第7天，實驗組細胞總數(shù)（106個）總數(shù)為12.01±0.30，對照組則為5.12±

18、0.26;培養(yǎng)第14天，實驗組細胞總數(shù)（106個）總數(shù)為18.05±0.28，對照組則為7.05±0.23。
　　 3.骨髓源性肝干細胞各個亞群的數(shù)量變化
　　 表達CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人BMDLSC各亞群的數(shù)量變化在第7天分別為4.94、4.89、6.70、5.72、5.03倍，及第14天數(shù)量增長倍數(shù)為7.60、7.76、11.70、21.38、8.12倍。實驗組中的各個亞群均有穩(wěn)

19、步的增長，其中以CD184的增加最為明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1.培養(yǎng)細胞總數(shù)的穩(wěn)定增長表明，TPO+HGF+IL-3組合培養(yǎng)方案是穩(wěn)定的純化、培養(yǎng)并有效擴增骨髓源性肝干細胞的方法，此方案能夠有效增加人骨髓源性肝干細胞的數(shù)量，解決了臨床應(yīng)用細胞移植所遇到的細胞數(shù)量不足的問題，為進一步開展肝干細胞移植提供了方便。
　　 2.骨髓源性肝干細胞可以作為肝組織工程重要的種子細胞來源。骨髓源性肝干細胞容易獲得，操作較為方