miR-133b對軸突生長的調(diào)控作用及其機制研究.pdf

1、腦、脊髓等CNS(central nerve system，中樞神經(jīng)系統(tǒng))損傷后可遺留嚴重的神經(jīng)功能障礙，威脅人類健康，影響人們生活質(zhì)量，并且目前尚無有效的治療方法。研究表明，腦、脊髓損傷后神經(jīng)傳導束無法再生是導致神經(jīng)功能難以恢復的重要因素之一。CNS損傷后局部環(huán)境中存在神經(jīng)元軸突生長抑制物，包括Nogo-A、MAG（myelin-associated glycoprotein，髓磷脂相關糖蛋白）和星形細胞分泌的CSPG（Chondro

2、itin sulphate proteoglycans，硫酸軟骨素蛋白多糖）。這些抑制分子與軸突頂端的生長錐接觸后，可與神經(jīng)元細胞膜上的Nogo受體等結合后激活Rho隨后活化Rho相關激酶(Rho-associated kinase，ROCK)，導致神經(jīng)元細胞骨架結構發(fā)生變化，繼而引起生長錐塌陷、回縮，神經(jīng)軸突停止生長。
　　MicroRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，能夠識別其靶基因3'UTR區(qū)的互補位點并與之結合，通過轉錄后途徑

3、調(diào)控靶基因蛋白的表達，其在CNS發(fā)育過程中具有重要作用。最近，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在神經(jīng)細胞軸突生長、分叉、導向和再生中也扮演重要角色，比如miR-34a可調(diào)控小鼠軸突生長和脊髓形態(tài)、功能，miR-124a與軸突分叉密切相關，而lin-4 miRNA等則與神經(jīng)軸突導向、靶細胞定位等相關。研究報道m(xù)iR-133b在多種腫瘤組織中差異表達，包括前列腺癌、肺癌和消化道腫瘤。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，miR-133b在人類及小鼠的中腦組織中表達

4、增高，并且能夠通過調(diào)控靶基因Pitx3的表達在中腦多巴胺神經(jīng)元的分化中起重要作用。另外Yu等人發(fā)現(xiàn)miR-133b與脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復有關，而且與卒中后功能恢復也密切相關，但是miR-133b在神經(jīng)細胞中對于軸突生長的作用及相關機制尚未有研究，另外miR-133b是否與CNS損傷后軸突生長抑制分子對神經(jīng)傳導束再生的抑制作用相關亦無報道。
　　目的:探討miR-133b對神經(jīng)細胞軸突生長的調(diào)控作用及其分子機制。
　　方法:

5、
　　第一部分:制備miR-133b過表達和miR-133b inhibitor以及相應對照慢病毒，并通過GFP（Green Fluorescent Protein，綠色熒光蛋白）表達量篩選最佳轉染效率。首先分別轉染miR-133b過表達和對照慢病毒，qRT-PCR方法檢測兩組細胞中miR-133b表達量，并進一步分析兩組細胞軸突生長情況;其次通過miR-133binhibitor干擾細胞內(nèi)miR-133b表達并觀察其對軸突生長的

6、影響;另外，利用TUNEL和MTT方法檢測miR-133b對PC12細胞凋亡和增殖的影響;最后利用NGF（Nerve growth factor，神經(jīng)生長因子）進一步探究miR-133b是否與神經(jīng)分化相關。
　　第二部分:制備RhoA特異性sh-RNA和RhoA過表達質(zhì)粒及相應對照質(zhì)粒。利用Western blot和qRT-PCR的方法檢測過表達或抑制miR-133b對RhoA蛋白及mRNA表達的影響及相互關系。通過sh-RNA抑

7、制細胞內(nèi)RhoA蛋白表達，進一步研究RhoA蛋白對PC12細胞軸突生長的影響，最后通過補救實驗驗證miR-133b對促進PC12細胞軸突生長的作用機制是否呈RhoA依賴性。
　　第三部分:利用Western blot方法檢測miR-133b過表達是否能促進某些軸突生長相關通路的激活（如MAPK和PI3K/Akt等）;接著干擾細胞內(nèi)miR-133b觀察這些通路可否被抑制，另外利用通路特異性抑制劑抑制關鍵分子磷酸化驗證miR-133b

8、對軸突生長的調(diào)控是否是通路依賴性;最后利用sh-RNA等技術觀察miR-133b靶基因的表達是否與這些通路的激活相關。
　　第四部分:體外提取、培養(yǎng)、純化大鼠原代神經(jīng)元細胞，通過慢病毒調(diào)控神經(jīng)元內(nèi)miR-133b表達，觀察其是否神經(jīng)元神經(jīng)軸突生長相關。另外利用CSPG體外模擬CNS損傷后對軸突生長的抑制作用，觀察miR-133b能否減弱軸突生長抑制因子對神經(jīng)軸突生長的抑制作用。
　　結果:
　　第一部分:在PC12細胞

9、中，miR-133b調(diào)控其軸突的生長，過表達miR-133b促進軸突生長，相反，下調(diào)PC12細胞中miR-133b表達抑制軸突生長，但是miR-133b不影響PC12細胞的神經(jīng)分化。
　　第二部分:過表達miR-133b抑制PC12細胞中RhoA蛋白的表達，但是對mRNA沒有影響。利用質(zhì)粒介導的shRNA干擾PC12細胞內(nèi)RhoA表達能夠模擬miR-133b對軸突生長的促進作用，而共轉染RhoA質(zhì)粒和可消除miR-133b對PC1

10、2細胞軸突生長的促進作用。
　　第三部分:miR-133b的過表達促進了ERK1/2和Akt絲氨酸473位點的磷酸化，但是對p38的磷酸化沒有影響，而且加入PI3K抑制劑LY294002和MAPK激酶MEK1抑制劑PD098059可以分別消除miR-133b對軸突生長的促進作用。和過表達miR-133b類似，抑制RhoA蛋白的表達也促進了ERK1/2和Akt(Ser473)的磷酸化。
　　第四部分:在大鼠原代皮層神經(jīng)元中，過

11、表達miR-133b能夠通過抑制RhoA蛋白的表達促進神經(jīng)軸突的生長;神經(jīng)軸突的生長在CSPG包被的培養(yǎng)皿中受到抑制，而miR-133b可以逆轉其抑制作用促進軸突生長。
　　結論:綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)miR-133b可以促進神經(jīng)軸突的生長，可能的機制是miR-133b抑制了神經(jīng)細胞中RhoA蛋白的表達和RhoA/ROCK信號通路，并減弱了CSPG對神經(jīng)軸突生長的抑制作用，同時激活了MEK/ERK和PI3K/Akt信號通路，從而促進